СИНЕРГИЗМ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ И КОНВЕНЦИАЛЬНЫХ АНТИБИОТИКОВ
Жаркова М.С.
ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия
Антимикробные пептиды (АМП) являются ключевыми молекулами врожденного иммунитета. Изучение синергетических эффектов антибактериального действия АМП и используемых в медицине антибиотиков является частью поиска оптимальных путей применения АМП в медицине, учитывая необходимость снижения эффективных концентраций пептидов и, следовательно, их токсичности. Также представляет интерес возможное взаимодействие между экзогенными антибиотиками и эндогенными АМП человека. В данной работе рассматривается совместное антибактериальное действие АМП (PG-1, СЬВас3.4, LL-37, НЫР1, НЫР4, ЬВБ2, ЬВБЗ и лизоцима) и антибиотиков (рифампицина, полимикси-на В, гентамицина, офлоксацина и оксацилина) в отношении грамположительных (MRSA АТСС 33591 и M.luteus С1Р А270) и грамотрицательных (E.coli ML-35p и A.baumannii) штаммов и выявляются комбинации веществ, для которых наблюдается синергетическое взаимодействие.
Ключевые слова: синергизм, антимикробные пептиды, антибактериальное действие
Антимикробные пептиды (АМП) и белки относятся к ключевым молекулам врождённого иммунитета человека и животных: входят в состав гранулярного аппарата ней-трофилов и секретируются эпителиями кожи и слизистых [1]. Для соединений этой группы характерен широкий спектр антибиотического действия, в частности, против мультире-зистентных микроорганизмов, устойчивых к конвенциальным антибиотикам. Кроме того, показано, что устойчивость микроорганизмов к АМП вырабатывается значительно труднее [1, 2]. Для ряда АМП помимо прямого микробного киллинга показаны иммуномо-дулирующие эффекты, участие в ранозажив-лении [2]. В настоящее время эти соединения рассматриваются в качестве перспективных моделей, на основе которых возможно создание новых лекарственных средств [1, 3].
Одним из препятствий к внедрению АМП и белков в клиническую практику является сравнительно высокая токсичность большинства из них в отношении эукариотических клеток [3]. При совместном применении различных антибиотических агентов возможно взаимное усиление их противомикробной активности, что позволило бы снизить эффективные концентрации данных веществ и, соответственно, уменьшить нежелательные
побочные эффекты. Изучение совместного действия АМП человека и конвенциальных антибиотиков представляет интерес не только как способ снижения эффективной концентрации и, следовательно, токсичности АМП, но и в контексте возможного взаимодействия эндогенных и экзогенных антибиотических веществ в организме человека при лекарственной терапии. Кроме того изучение природы синергических эффектов при сочетанном применении АМП и синтетических антибиотиков с известными мишенями антимикробного действия может способствовать пониманию молекулярно-клеточных механизмов действия самих АМП.
Цель данной работы состояла в изучении in vitro совместного антибактериального действия АМП человека (LL-37, альфа-дефенсинов HNP1 и HNP4, бета-дефенсинов hBD2 и hBD3), а также протегрина-1 (PG-1) свиньи, бактенецина 3.4 (ChBac3.4) козы и антимикробного белка лизоцима с клиническими антибиотиками (рифампицином, полимиксином B, гентамицина сульфатом, оксациллином и офлоксацином), имеющими различные механизмы антимикробного действия, в отношении грамотрицательных бактерий: Escherichia coli ML-35p и клинического изолята Acinetobacter baumannii - и грампо-
ложительных бактерий: устойчивого к мети-циллину штамма Staphylococcus aureus (MRSA ATCC 33591) и Micrococcus luteus CIP A270.
Материалы и методы.
Антимикробные агенты. Использовали химически синтезированные АМП, идентичные природным: ChBac3.4 - синтез выполнен в ГосНИИ ОЧБ (РФ), PG-1 - любезно предоставлен профессором Р. Лерером (Калифорнийский университет Лос-Анджелеса, США), АМП человека (LL-37, HNP1, HNP4, hBD2 и hBD3) производства Peptide Institute, Inc (Япония). Использовали лизоцим из белка куриных яиц (BioChemica, Германия) и применяемые в клинике антибиотики: рифампи-цин (Sigma, США), оксациллин (Sigma, США), полимиксин В (BioChemica, Германия), ген-тамицин сульфат (раствор для внутривенного и внутримышечного введения 40 мг/мл, Shandong Weifang Pharmaceutical Factory Co., КНР), офлоксацин (раствор для инфузий 2 мг/мл, ОАО Синтез, РФ). Растворы антибиотиков помимо действующего вещества дополнительно содержали только хлорид натрия.
Бактериальные штаммы. Штаммы E.coli ML-35р и MRSA ATCC 33591 были любезно предоставлены профессором Р. Лерером (Калифорнийский университет Лос-Анджелеса, США); M.luteus ClP A270 - сотрудниками отдела Молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН; клинический изолят A.baumannii -сотрудниками НИИ Травматогии и ортопедии им. Вредена РАМН.
Оценка совместного микробицидного действия. Наличие синергетических эффектов при совместном действии антимикробных пептидов и белков с конвенциальными антибиотиками на грамотрицательные и грамположитель-ные микроорганизмы выявляли с помощью серийных разведений по методу «шахматной доски» ("checkerboard titrations") [4]. Использовали культуры микроорганизмов, находящихся в логарифмической фазе роста. Культивацию проводили в 2,1% бульоне Мюллера-Хинтон M391 (HiMedia, Индия) при 37 °C (в термостате с лабораторной качалкой (шейкером)). Использовали 60-луночные стерильные микрокамеры Терасаки с V-образным дном (Медполимер, РФ). Перед экспериментом лунки обрабатывали стерильным 0,1% раствором бычьего сывороточного альбумина для снижения неспецифического связывания препаратов со стенками планшета.
В соответствии с методом «шахматной доски» одно из антимикробных веществ (А) двукратно разводится по горизонтали, а другое (В) - по вертикали. В результате в каждой лунке получают определенную комбинацию концентраций препаратов А и В. В соответствии с этой схемой в лунки 60-луночной микрокамеры Терасаки вносили по 2,5 мкл соответствующих разведений исследуемых веществ в 0,01 М натрий-фосфатном буферере рН 7,4. В крайние лунки вместо второго вещества вносили аналогичный объём буфера. В результате все лунки содержали по 5 мкл растворов антимикробных препаратов или их комбинаций. Затем в лунки вносили такой же объём бактериальной суспензии. Конечная концентрация бактерии в пробах составляла 0,5-105 КОЕ/мл. Начальная концентрация каждого из исследуемых препаратов равнялась МИКх2. Величины МИК были предварительно получены методом серийных разведений препарата в питательной среде, содержащей микроорганизмы, в моификации, предложенной Тосси и соавторами [5].
Планшеты с пробами инкубировали в термостате при 37 °С в течение ночи (16-18 часов). Регистрацию результатов производили на следующий день, визуально отмечая наличие или отсутствие роста микроорганизма в соответствующих лунках. Характер совместного действия веществ А и В оценивали с помощью индекса фракционной ингибирующей концентрации (иФИК), рассчитываемого по формуле: ФИК индекс = ФИК А + ФИК В = [А]/ [МИК А] + [В]/[МИК В], где [А] и [В] - концентрации веществ А и В соответственно. Согласно использованной методике иФИК<0,5 соответствует синергизму [4], 0,5<иФИК<1 -аддитивности, 1<иФИК<2 - независимому действию, иФИК>2 - антагонизму [4].
Результаты и обсуждение. Результаты измерения иФИК приведены в табл. В связи с высокими значениями МИК (свыше 40 мкМ) эксперименты с КЬ-37 и ЬВБ2 против MRSA АТСС 33591 и с и ЬВБ2 против E.coli ML-35p
не проводились. Эксперименты с оксацилли-ном против E.coli ML-35p не проводились в связи с высокой устойчивостью данного штамма к антибиотикам пенициллинового ряда.
Наличие синергетического эффекта было выявлено для комбинаций СЬВае3.4 с рифам-пицином в отношении E.coli ML-35p; с окса-циллином в отношении штамма MRSA АТСС 33591, обладающего высокой устойчивостью
к действию данного антибиотика; с офлокса-цином в отношении M.luteus С1Р А270. Также синергизм показан для сочетаний PG-1 с ген-тамицина сульфатом в отношении грамотри-цательных микроорганизмов и, в меньшей степени, в отношении грамположительного штамма M.luteus С1Р А270. Взаимное усиление антимикробной активности наблюдается также при совместном действии лизоцима и полимиксина В на грамотрицательные бактерии. Это может быть связано с облегчением доступа мурамидазы к пептидогликановому
слою, покрытому у этих микроорганизмов дополнительной липидной мембраной, которая, в свою очередь, является мишенью действия антибиотика.
Среди АМП человека синергетический эффект выявлен для комбинаций hBD3 с гента-мицином в отношении грамотрицательных бактерий; hBD2 с рифампицином и полимик-сином В в отношении A.baumannii и также с полимиксином В в отношении M.luteus CIP A270; HNP1 и hBD3 с рифампицином в отношении MRSA ATCC 33591; LL-37, HNP1, hBD2
Таблица. Минимальные индексы фракционных ингибирующих концентраций*
бактерия вещество А вещество B
рифампицин полимиксин В гентамицина сульфат офлоксацин оксациллин
HNP1 0,5 1,12 0,75 1 1
HNP4 0,75 1,12 1 1 1,12
MRSA hBD3 0,5 1 0,75 0,75 0,75
ATCC 33591 ChBac3.4 0,75 0,62 0,75 1 0,5
PG-1 0,75 0,62 1 1 0,75
лизоцим 0,62 0,56 0,53 1,12 0,53
LL-37 0,75 0,56 0,5 0,75 0,75
HNP1 0,75 0,75 0,5 1 1
HNP4 0,75 0,75 0,56 1 0,75
M.luteus hBD2 0,75 0,5 0,38 0,75 0,75
CIP A270 hBD3 0,62 0,75 0,38 0,62 1
ChBac3.4 0,75 0,75 0,62 0,5 0,75
PG-1 0,75 0,62 0,5 1 0,75
лизоцим 0,75 0,62 0,62 0,62 0,75
LL-37 0,75 0,75 0,75 1,12 -
HNP1 0,56 1 0,62 1,12 -
E.coli hBD3 0,75 0,75 0,28 0,53 -
ML-35p ChBac3.4 0,5 1 1 0,75 -
PG-1 0,75 1 0,38 0,62 -
лизоцим 0,62 0,25 0,52 1,12 -
LL-37 1,12 1 0,75 1 2
HNP1 0,75 1 0,62 0,75 0,75
HNP4 1,12 1 0,62 1 1
A.baumannii hBD2 0,5 0,38 0,75 1 1
(клинич. изол.) hBD3 1,12 0,62 0,5 1,12 1
ChBac3.4 0,75 0,75 1 1 0,75
PG-1 1,12 0,75 0,38 1 1,12
лизоцим 1 0,5 0,75 1 1
*Полужирным начертанием обозначены случаи синергетического действия веществ А и В, обычным шрифтом -аддитивного действия, курсивом - независимого действия.
и ЬББ3 с гентамицином в отношении M.luteus С1Р А270. В остальных случаях преимущественно наблюдалось аддитивн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.