научная статья по теме SINGULISPHAERA MUCILAGENOSA SP. NOV. – НОВЫЙ АЦИДОТОЛЕРАНТНЫЙ ПРЕДСТАВИТЕЛЬ ПОРЯДКА PLANCTOMYCETALES Биология

Текст научной статьи на тему «SINGULISPHAERA MUCILAGENOSA SP. NOV. – НОВЫЙ АЦИДОТОЛЕРАНТНЫЙ ПРЕДСТАВИТЕЛЬ ПОРЯДКА PLANCTOMYCETALES»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 80, № 1, с. 105-111

= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =

УДК 631.46.579.832.4.083.12(470-252.62)

SINGULISPHAERA MUCILAGENOSA SP. NOV. - НОВЫЙ АЦИДОТОЛЕРАНТНЫЙ ПРЕДСТАВИТЕЛЬ ПОРЯДКА PLANCTOMYCETALES

© 2011 г. М. В. Зайчикова*, Ю. Ю. Берестовская*, В. Н. Акимов**, Н. А. Кострикина*, Л. В. Васильева*,1

*Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва **Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

РАН, Пущино, Московская обл.

Поступила в редакцию 23.03.2010 г.

Два штамма почкующихся бактерий, обозначенные как Z-0071T и Z-0072, были выделены из дистрофной гумифицированной воды, сформированной ксилотрофными грибами в процессе деградации древесины ели. Клетки обоих штаммов кокковидной формы, одиночные или в парах, неподвижные, размером 0.95— 1.80 мкм. Поверхность клеток покрыта фимбриями и слизистой капсулой, толщина которой может достигать 0.3 мкм. Клетки содержат сложный комплекс внутриклеточных мембран. Оба штамма являются аэробными органогетеротрофными, мезофильными и ацидотолерантными организмами. Способны к росту в микроаэробных условиях. В качестве субстратов используют N-ацетилглюкозамин, углеводы, а также лактат Штаммы растут в интервале рН 4.0—7.5 с оптимумом рН 6.0—6.5. Температурные пределы роста 4— 30°С, с оптимумом при 25—28°С. Как обитатели дистрофных ультрапресных вод штаммы Z-0071T и Z-0072 чувствительны к содержанию NaCl и выдерживают не более 0.5% NaCl в среде. Основными жирными кислотами у штаммов Z-0071T и Z — 0072 являются: С16:0, С18:1ш9с, Q^^ 12с. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 51.2—51.7 мол. %. Штаммы Z-0071T и Z — 0072 имеют идентичные нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК (определен фрагмент длиной 1310 нуклеотидов) и имеют по данному гену 94.3% сходства с типовым штаммом ближайшего вида Singulisphaera acidiphila M0B10T. По совокупности фенотипических и филогенетических признаков штаммы Z-0071T и Z-0072 описаны в качестве нового вида рода Singulisphaera — Singulisphaera mucilagenosa sp. nov с типовым штаммом Z-0071T (ВКМ В-2626).

Ключевые слова: ксилотрофное сообщество, планктомицеты, разложение древесины, ультрапресные воды, ацидотолерантные бактерии.

Планктомицеты — широко распространенная в природных экосистемах группа микроорганизмов [1—3]. Представители планктомицетов, выделенные в чистые культуры, образуют порядок Planctomyce-tales c семейством Planctomycetaceae, которое в настоящее время содержит 9 родов: Planctomyces, Pirel-lula, Gemmata, Isosphaeara, Schlesneria, Singulisphaera, Zavarzinella, Rhodopirellula, Blastopirellula [1, 3—6]. Молекулярные методы исследования подтвердили ранние визуальные наблюдения и показали наличие планктомицетов в наземных, морских, пресноводных экосистемах, индустриальных источниках, а также взаимосвязь этих бактерий с другими организмами [1, 7]. Однако их экологическая роль плохо осознана, поскольку мало исследованы физиолого-биохимические особенности планктомицетов в культурах.

Целью настоящей работы было изучение и таксономическое описание новых представителей порядка Planctomycetales — штаммов Z-0071T и Z-0072.

1 Автор для корреспонденции (e-mail: lvasilyeva@mail.ru).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования и источник выделения.

Штаммы Z-0071Т и Z-0072 были выделены из дистрофной, слабогумифицированной, кислой (рН 4.3), ультрапресной (электропроводность 140 мкСм) воды микролизиметра, в котором происходило разложение древесины ели ксилотрофным сообществом грибов.

Состав сред и условия культивирования. Штаммы Z-0071Т и Z-0072 выделяли на ультрапресной минеральной среде "РС", которая содержала на литр: 5 мл солей Хатнера [1] в качестве минеральной основы, 10 мл культуральной жидкости грибов в качестве источника углерода и энергии и 0.05 г/л дрожжевого экстракта в качестве фактора роста [8]. Чистые культуры поддерживали на жидкой минеральной среде "МС", которая содержала в качестве минеральной основы 20 мл солей Хатнера [1] (рН 6.0) с сахарозой (1 г/л) в качестве субстрата и дрожжевым экстрактом (0.05 г/л) в качестве фактора роста.

Микроскопические исследования. Морфологию клеток изучали в световом микроскопе с фазовым контрастом ("АтрИуаГ', Германия), а также элек-

тронном микроскопе ("JEM-100C", Япония), используя негативно-окрашенные препараты клеток и ультратонкие срезы. Клетки контрастировали 1% раствором уранилацетата. Для получения ультратонких срезов клетки предварительно фиксировали глутаровым альдегидом с последующей дофиксаци-ей осмиевой кислотой на кокадилатном буфере. Образцы заключали в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB и окрашивали цитратом свинца с докрашиванием 3% водным раствором уранилацетата.

Определение физиологических свойств штаммов Z-0071x и Z-0072. Спектр субстратов, используемых штаммами в качестве источника углерода, определяли на жидкой среде "МС". В качестве источников углерода и энергии исследовали: N-ацетилглюкоза-мин, сахара — арабинозу, ксилозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, маннозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, раффинозу, крахмал, ксилан; спирты — глицерин, сорбит, маннит; соли органических кислот — формиат, ацетат, бутират, пропионат, пируват, фумарат, сукци-нат, оксалат, оксалоацетат, цитрат, малат, бензоат; первичные спирты — метанол, этанол; аминокислоты: — метилаланин, глутамат, лейцин, цистеин, ас-партат, а также метиламины. Тестируемые субстраты вносили в среду в концентрации 1.0 г/л.

Интенсивность дыхания при росте на целлюлозе определяли по изменению количества углекислого газа в экспериментальных флаконах с использованием инфракрасного СО2-анализатора "INFRALIT-4" (GUNKALOR-DESAU, Германия). Величину пика образца сравнивали с величиной пика стандарта. Скорость образования СО2 (интенсивность дыхания) выражали в мг/л час, пересчитывая на объем пробы.

Способность к олиготрофному росту выделенных штаммов исследовали с использованием сахарозы в качестве субстрата в пределах концентраций 0.2—40.0 г/л. Рост бактерий регистрировали нефе-лометрически по изменению оптической плотности (ОП600) клеточной суспензии на спектрофотометре "UNICO 2100" в течение 14 сут при температуре 28°С.

Рост штаммов при значениях рН 3.0—8.0 определяли, добавляя 0.05 М растворы Na2HPO4 и KH2PO4 к основной среде. Рост бактерий в пределах рН 3.0— 4.8 исследовали, подкисляя основную среду 0.1 N раствором HCl до нужного значения рН, который определяли потенциометрически на рН-метре-ио-номере "Эксперт 001" (Россия).

Температурные пределы роста изучали в интервале 2—37°С.

Зависимость роста выделенных штаммов от содержания NaCl в среде исследовали в пределах концентраций 0.02—1.5%.

Температурный и рН оптимумы роста штаммов Z-0071T и Z-0072, а также зависимость роста от со-

держания NaCI в среде определяли с использованием сахарозы в качестве субстрата.

Способность к литоавтотрофному росту оценивали по изменению оптической плотности клеточной суспензии (ОП600) и потреблению водорода при культивировании штаммов Z-0071T и Z-0072 в жидкой среде с газовой фазой Н2 : О2 : СО2 в соотношении (7 : 2 : 1). Водород измеряли на газовом хроматографе "ЛХМ-80" с катарометром. Разделение проводили на колонке, заполненной молекулярным ситом 5А.

Способность культур к росту в микроаэробных условиях проверяли с использованием полужидкой агаризованной среды (1%) [9].

Способность культур к росту на разных источниках азота определяли на жидкой минеральной среде, содержащей (г/л): КН2РО4 - 0.45; К2НР04 - 0.84; MgS04 — 0.30 с сахарозой. Тестируемые источники азота (0.05%): сульфат аммония, нитрат калия, нитрит калия, мочевина, метиламин, триметиламин, N-ацетилглюкозамин, дрожжевой экстракт, пептон, а также аминокислоты: лейцин, глутамат, тирозин, треонин, серин, аланин, триптофан.

Способность культур к росту на низкоминерализованных средах проверяли с использованием сред с разным содержанием минеральных солей по их электропроводности. В ходе исследования основную среду "МС" разбавляли в соотношениях 1 : 2; 1 : 4; 1: 10, что соответствовало значениям электропроводности (мкСм): 1760, 779, 410, 145.

Чувствительность штаммов Z-0071T и Z-0072 к антибиотикам: линкомицину (10 мкг), новобиоцину (30 мкг), ампициллину (10 мкг), хлорамфениколу (30 мкг), неомицину (10 мкг), гентамицину (10 мкг), канамицину (30 мкг), стрептомицину (10 мкг) устанавливали по размеру зоны отсутствия роста клеток вокруг тест-дисков с антибиотиками ("Oxoid") на агаризованной среде.

О наличии каталазной активности судили по образованию пузырьков кислорода при воздействии на клетки 3% раствором перекиси водорода; наличие оксидазы - по изменению цвета колонии при нанесении на нее реагента REF-55635.

Состав жирных кислот (ЖК) в липидах обоих штаммов определяли на хроматографе Microbial Identification System (Sherlok) фирмы "MIDI Inc." (Newark, США) в соответствии с методикой [10]. Идентификацию разделенных ЖК проводили на масс-спектрометре Agilent Technologies AT-5971 SMART

Состав хинонов определяли после их экстракции из клеток. Экстракцию, очистку и масс-спектромет-рический анализ на приборе LCQ ADVANTAGE MAX ("Финниган", Германия), проводили в соответствии с методикой, описанной ранее [11].

Молекулярно-генетические исследования. Выделение, очистку ДНК, определение Г + Ц в соста-

Рис. 1. Фазово-контрастная микрофотография клеток 81щыШркаега шыа^тоза 8р. поу. штамма Z-0071Т в 10-суточной культуре. Маркер — 0.5 мкм.

ве ДНК проводили по описанным ранее методикам [12].

Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК у штаммов Z-0071T и Z-0072 проводили следующим образом. ДНК выделяли феноль-ным методом [14]. Амплификацию гена 16S рРНК проводили с универсальными эубактериальными праймерами 27f и 1492r на приборе GeneAmp PCR System 2700 ('Applied Biosystems", США). Секвени-рование амплифицированного фрагмента гена 16S рРНК проводили на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL ("Beckman Coulter", США) в соответствии с инструкцией производителя. Для нахождения близкородственных штамму Z-0071T организмо

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком