научная статья по теме СИНХРОННАЯ И РЕЦИПРОКНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ЦИСТЕИНОВЫХ ПРОТЕАЗ ПРИ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ Медицина и здравоохранение

Текст научной статьи на тему «СИНХРОННАЯ И РЕЦИПРОКНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ЦИСТЕИНОВЫХ ПРОТЕАЗ ПРИ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ»

НЕЙРОХИМИЯ, 2013, том 30, № 1, с. 29-34

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

УДК 612:822.3

СИНХРОННАЯ И РЕЦИПРОКНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ЦИСТЕИНОВЫХ ПРОТЕАЗ ПРИ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ

© 2013 г. И. В. Кудряшова*, М. В. Онуфриев

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук, Москва

На переживающих срезах гиппокампа крыс Вистар исследовали скоррелированность модификаций активности цистеиновых протеаз при разных моделях индукции долговременной пластичности. СА3-СА1 LTD вырабатывали по стандартной методике, предъявляя 900 импульсов с частотой 1 Гц. Для индукции LTP применяли высокочастотное раздражение коллатералей Шаффера (100 Гц, 1 с, ВЧР), с последующим тестированием в течение 1 ч. По окончании экспериментов срезы замораживали и в каждом отдельном срезе определяли активность каспазы-3 и калпаина. Предполагалось, что увеличение внутриклеточного кальция при долговременной пластичности может сопровождаться синхронной регуляцией этих протеолитических ферментов. Комплексное исследование протеолитической активности калпаина и каспазы-3 подтвердило, что в условиях долговременной пластичности действительно происходит изменение баланса активации ферментов, причем такие изменения оказались специфичными для разных экспериментальных ситуаций. В пассивном контроле (срезы, не подвергавшиеся электрической стимуляции) корреляционная связь активности ферментов отсутствовала и появлялась после стимуляции коллатералей Шаффера в любом режиме, используемом для индукции долговременной пластичности. При выработке LTD и при депотенци-ации обнаружена положительная корреляция каспазы-3 и калпаина, что, как и предполагалось, может быть связано с каспаз-зависимым протеолизом естественного ингибитора калпаина калпаста-тина. Однако в группе срезов с остаточной потенциацией (1 ч после ВЧР) обнаружена обратная корреляция, что не согласуется с исходной гипотезой. Обсуждаются возможные механизмы инверсии в регуляции баланса активации цистеиновых протеиназ.

Ключевые слова: переживающие срезы гиппокампа, долговременная депрессия, долговременная потен-циация, каспаза-3, калпаин.

Б01: 10.7868/81027813313010056

При исследовании молекулярных основ обучения и памяти было обнаружено, что осуществление долговременных модификаций нуждается в поддержке многих известных ферментативных комплексов [1, 2]. Те же ферменты, как известно, вовлекаются в обеспечение и других клеточных функций, включая нейродегенеративные изменения [3]. Тип реакции, по-видимому, зависит от компарментализации и доступности других молекулярных посредников. Поэтому системный подход может быть перспективным и для этой области исследования [4].

Было обнаружено, что наряду с разнообразными и наиболее изучаемыми системами фосфори-лирования/дефосфорилирования [5], в структурно-функциональные модификации при долговременной пластичности вовлекаются также и некоторые протеолитические комплексы [6, 7]. В

* Адресат для корреспонденции: 117485, Москва, ул. Бутлерова, 5а, e-mail: iv_kudryashova@mail.ru.

частности, к ним относятся и цистеиновые проте-азы [1, 8, 9].

Также как и каспаза-3 [1], калпаин является Са2+-зависимым ферментом [10], и это определяет их синхронную активацию при увеличении внутриклеточного содержания кальция. В частности, это происходит при активации ММЭА рецепторов [11—13], хотя кальций, входящий по потенциал-зависимым каналам, такой реакции не вызывает [14]. Эти ферменты имеют как общие, так и разные субстраты [1] и, следовательно, конечный результат модификаций может видоизменяться в соответствии с долей их участия.

Рассмотрение относительного вклада калпаи-нов и каспаз в синаптическую пластичность затруднено нарастающим числом данных о взаимодействии между этими двумя протеолитическими системами. Естественным ингибитором калпаина является калпастатин [15—17], который, как известно, подвергается фрагментации при активации каспазы-3 [18, 19]. Считается, что при этом

снижается ферментативная активность калпаста-тина, что создает дополнительные условия для совместной активации исследуемых протеиназ.

В работе предполагалось проверить гипотезу о синергичности изменений каспазы-3 и калпаина в условиях долговременной пластичности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Электрофизиологические эксперименты проводили на переживающих срезах гиппокампа крыс Вистар массой 90—180 г. Состав перфузионной среды (мМ): NaCl 124; KCl 5; MgSO4 • 7H2O 1.3; CaCl2 2.5; NaH2PO4 1; NaHCO3 26; D-глюкоза - 10; карбоген — 95% O2 и 5% CO2; pH 7.3-7.4, температура 34.3°С. Для регистрации фокальных потенциалов в пирамидном слое поля CA1 использовали стеклянные микроэлектроды, заполненные 0.33 M раствором хлористого натрия. Раздражающие биполярные электроды устанавливали в радиальном слое на коллатерали Шаффера. Перед началом основного эксперимента определяли пороговую силу стимуляции и зависимость амплитуды ответа от интенсивности раздражения. В ходе дальнейшего эксперимента использовали интенсивность тестирующего раздражения, при которой амплитуда ответов не превышала 40-45% от максимальной. LTD вырабатывали по стандартной методике, предъявляя 900 импульсов с частотой 1 Гц. Для индукции LTP применяли высокочастотное раздражение коллатералей Шаффера (1 с, 100 Гц). До и в течение 1 ч после тетанизации тестирование электрофизиологических показателей производили с интервалом 30 с.

Сразу после тестирования срезы замораживали при температуре -70°С. Активность каспазы-3 или калпаина определяли в каждом отдельном срезе флюориметрическим методом. Для определения активности каспазы-3 пробы инкубировали 60 мин при 37°С в реакционном буфере, содержащем 150 мМ HEPES, pH 7.4, 15%-ную сахарозу, 15 мМ дитиотрейтол, 0.15% CHAPS (все — Sigma, США), 1 мМ ЭДТА, в двух параллельных образцах, один из которых содержал 50 мкМ N-ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-7-амино-4-трифторметилкумарин (Ac-DEVD-AMC, флюорогенный субстрат каспа-зы-3, Biomol, США), а другой 50 мкМ N-ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-7-амино-4-метилкумарин и 5 мкМ N-ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-СНО (Ac-DEVD-CHO, конкурентный ингибитор каспазы-3, Biomol, США), конечная концентрация белка составляла 0.5 мг/мл. Флюоресценцию регистрировали при длинах волн возбуждения и эмиссии 400 и 490 нм соответственно на спектрофлюориметре Hitachi F-3000, оборудованном микрокюветой. Активность каспазы-3 рассчитывали по разности скоростей накопления свободного 7-амино-4-ме-тилкумарина в пробах, содержащих и не содержа-

щих специфический ингибитор каспазы-3, и выражали в пмоль/мин/мг белка. В качестве флюоресцентного стандарта использовали 7-амино-4-метилкумарин (Sigma, США). Определение активности калпаина проводили флюориметрическим методом с использованием синтетического субстрата suc-LLVY-AMC (N-сукцинил-Лей- Лей-Вал-Тир-7-амино-4-метилкумарин). Для определения активности калпаина пробы инкубировали 60 мин при 37°С в реакционном буфере, содержащем 20 мМ трис/HCl, рН 7, 4, 5 мМ CaCl2, 1 мМ ДТТ, 50 мкМ suc-LLVY-AMC, конечная концентрация белка составляла 0.5 мг/мл. Для определения специфичности расщепления субстрата Са2+-зависимым калпаином в параллельный образец вносили все компоненты кроме 5 мМ CaCl2 и по 10 мМ ЭДТА и ЭГТА. Флюоресценцию образовавшегося АМС регистрировали, как описано выше. Активность калпаина рассчитывали по разнице скоростей расщепления suc-LLVY-AMC в образцах в присутствии Са2+ или хелаторов Са2+.

Для определения достоверности межгрупповых различий использовали i-критерий Стьюдента. Для оценки статистической связи активности про-теолитических ферментов использовали коэффициент корреляции Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Измеряя активность протеолитических ферментов в каждом отдельном срезе, не обнаружено однозначных подтверждений гипотезы об активирующем влиянии каспазы-3 на калпаин. Оказалось, что взаимоотношения этих ферментов существенным образом зависят от условий тестирования при проведении электрофизиологического эксперимента.

В пассивном контроле (срезы, не подвергавшиеся электрической стимуляции) корреляционная связь активности ферментов отсутствовала (r = = 0.17, p = 0.68). При этом активность обеих протеиназ варьировала в достаточно широком диапазоне (от 1.61 до 3.52 пмоль/мин/мг для каспазы-3 и от 2.28 до 3.29 пмоль/мин/мг для калпаина). Это, по-видимому, исключает возможность объяснения полученных результатов преимущественным влиянием случайной вариабельности, превышающим влияние скоррелированных модификаций из-за ограничения их диапазона. Скорее всего, синхронизация активации ферментов может происходить только при определенных условиях. Самый серьезный претендент на роль синхронизирующего сигнала — увеличение внутриклеточного содержания ионов кальция. Наиболее изученными моделями Са2+-зависимой долговременной пластичности являются долговременная потенци-ация и долговременная депрессия.

Комплексное исследование протеолитической активности калпаина и каспазы-3 подтвердило, что в условиях долговременной пластичности действительно происходит изменение баланса активации ферментов, причем такие изменения оказались специфичными для разных экспериментальных ситуаций.

Выработка LTD продолжалась в течение 15 мин. По окончании этой процедуры не обнаружено достоверных изменений активности каспазы-3 (2.05 ± 0.39 пмоль/мин/мг по сравнению с 2.36 ± ± 0.22 пмоль/мин/м в контроле, p = 0.62) или калпаина (2.65 ± 0.58 пмоль/мин/мг по сравнению с 2.75 ± 0.1 пмоль/мин/м в контроле, p = 0.91). Активность обоих ферментов хотя и была в среднем несколько снижена, однако не настолько, чтобы подтвердить или опровергнуть ее изменение в результате LTD. Тем не менее, не исключено, что активация одного из ферментов может происходить на более ранних стадиях выработки.

Основной задачей работы было исследование влияния Са2+-зависимой долговременной пластичности на взаимоотношения каспазы-3 и калпаина. Измерение активности этих ферментов в одних и тех же переживающих срезах гиппокампа после выработки LTD подтвердило синхронизирующее влияние этой процедуры. В частности, об этом свидетельствует достоверная связь активности фермен

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком