ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 5, с. 465-471
УДК 579.222
СИНТЕТАЗА ЦЕФАЛОСПОРИНОВ-КИСЛОТ ШТАММА Escherichia coli ВКПМ В-10182: ГЕНОМНЫЙ КОНТЕКСТ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНА, СОЗДАНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА
© 2015 г. М. А. Эльдаров*, А. В. Скляренко**, А. В. Марданов*, А. В. Белецкий*, А. А. Жгун*, М. В. Думина*, Н. В. Медведева**, Д. Э. Сатарова**, Н. В. Равин*, С. В. Яроцкий**
*Центр "Биоинженерия" РАН Москва, 117312 e-mail: eldarov@biengi.ac.ru. **Государственнъш научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва, 117545 Поступила в редакцию 26.03.2015 г.
Фермент синтетаза цефалоспоринов-кислот продуцируется штаммом E. coli ВКПМ В-10182, обладает специфичностью к синтезу Р-лактамных антибиотиков, относящихся к классу цефалоспори-нов-кислот (цефазолин, цефалотин, цефтезол и др.). Проведено сравнение ранее расшифрованной геномной последовательности штамма E. coli ВКПМ В-10182 с геномом родительского штамма E. coli ATCC 9637. Выявлены множественные мутации, свидетельствующие о долгой селекционной истории штамма, в том числе мутации в генах РНКаз и Р-лактамаз, которые могли способствовать повышению уровня синтеза фермента и снижению степени деградации синтезируемых цефалоспори-нов-кислот. Методами биоинформатики идентифицирован ген CASA — прямой гомолог гена пенициллин G-ацилазы, что подтверждено результатами клонирования гена, его экспрессии и определения ферментативной активности в реакции синтеза цефазолина. Ген CASA выделен и клонирован в оригинальный вектор экспрессии, в результате чего получен эффективный штамм E. coli BL21(DE3)/pMD0107 - продуцент CASA.
Ключевые слова: синтетаза цефалоспоринов-кислот, геномика, Eschericihia coli, ферментативный синтез, цефалоспорины, антибиотики, штаммы-продуценты, гетерологичная экспрессия.
DOI: 10.7868/S0555109915050050
Биокаталитический синтез ß-лактамных антибиотиков — эффективный метод получения полусинтетических пенициллинов и цефалоспоринов [1—5], основанный на использовании таких ферментов, как, например, пенициллинацилаза [6, 7], гидролаза эфиров а-аминокислот [8—10].
Фермент синтетаза цефалоспоринов-кислот (cephalosporin-acid synthetase, CASA), называемая также цефазолинсинтетазой, обладает специфичностью к синтезу ß-лактамных антибиотиков, относящихся к классу цефалоспоринов-кислот (цефазолин, цефалотин, цефтезол и др.) [11, 12]. CASA продуцируется штаммом E. coli 1787 (коллекция культур Государственного научного центра по антибиотикам) [13], а также фагоустойчивым штаммом E. coli FU 99-S [14], полученным методами химического мутагенеза, и более высокопродуктивным штаммом E. coli ВКПМ В-10182 [11]. Данные штаммы продуцируют комплекс пептидо-гидролаз с преобладающим содержанием фермента, специфичного к синтезу ß-лактамов-кислот, названного цефазолинсинтетазой или CASA [11].
Штамм ВКПМ В-10182, как производный от штамма E. coli W обладает целым рядом характеристик, которые делают его чрезвычайно привлекательным для применения в различных технологических процессах. Он продуцирует незначительное количество ацетата, даже в отсутствие жесткого контроля метаболизма углеводов, культивируется с образованием значительной биомассы при использовании метода подпиток (fed-batch) [15]. Штаммы W обладают высокой толерантностью к таким факторам, как например высокие концентрации этанола, закисление, высокие температуры и осмотический стресс [16]. Штаммы E. coli W растут гораздо быстрее на среде LB, чем классический штамм K-12- и его производные, что позволяет проводить на их основе разработку лабораторных штаммов для молекулярного клонирования [15]. В совокупности эти характеристики делают штаммы-производные от штамма E. coli W исключительно привлекательными в качестве основы для создания различных продуцентов. Существенно, что штаммы W являются единственными безопасными штаммами
466
ЭЛЬДAPОB и др.
E. coli, способными к утилизации сахарозы в качестве источника углерода, при этом скорость роста на сахарозе такая же как на глюкозе. [17].
Ранее нами была расшифрована геномная последовательность штамма BKПM B-10182 [18].
Цель работы — сравнительный биоинформационный анализ геномов штаммов E. coli BKПM B-10182 и А1СС 9637 (исходный родительский штамм), идентификация и выделение гена CASA и создание рекомбинантного штамма—продуцента CASA.
МЕТОДИКА
Материалы. Эндонуклеазы рестрикции, T4ДНK-лигаза, Taq-полимераза, Pfu ДНК-по-лимераза — производства "MBI Fermentas" (Литва), "Сибэнзим" (Новосибирск, Россия). Микробиологические среды — производства "Difco" (США), "Novagen" (США), реагенты для электрофореза и другие реактивы — компании "Sig-ma-Aldrich" (США). Стандартный образец це-фазолина (ЦЕЗ) — производства "RIBBON" (Италия). Препараты 3-[(5-метил-1,3,4-тиади-азол-2-ил)-тиометил]-7-аминоцефалоспорано-вой кислоты (ММТД-7-АЦК) и метилового эфира 1(Н)-тетразолилуксусной кислоты (МЭТЗУК) любезно предоставлены Сичуаньским индустриальным институтом антибиотиков (Китай).
Штаммы микроорганизмов. Для конструирования вектора pMD0107 использовали штамм E. coli XL1Blue [recA1 endA1 gyrA96 thi1 hsdR17 supE44 relA1 lac (F'proAB lacIqZ.M15 Tn10) (Tetr)] ("Strat-agene", США). Экспрессию CASA осуществляли в штамме E. coli BL21 (DE3) [15] [F, ompT, hsdSB (rB, mB), dcm,gal, dcm (DE3)] ("Novagen", США).
Сравнение геномов и биоинформационный анализ. Геном штамма E. coli BKПM B-10182 депонирован в базе данных GenBank под номером JRIA01000000, геном штамма E. coli ATCC 9637 — NC_017635.1. Для классификации предсказанных белков по различным функциональным категориям Киотской энциклопедии генов и геномов использовали сервер автоматической аннотации KEGG [19].
Для поиска различий между геномами родительского штамма E. coli ATCC 9637 и штамма BKПM B-10182 проводили картирование полиморфизмов и сравнение набора кодируемых белков. Для картирования полиморфизмов использовали программу GS Reference Mapper 2.9 с параметрами по умолчанию. Для сравнения набора генов использовали Blast [20], гены считались общими для двух геномов, если являлись взаимно-лучшими гомологами при Blast сравнении.
Идентификация гена CASA. Для поиска в геноме штамма E. coli BKПM B-10182 генов, способных кодировать белок с активностью синтетазы
цефалоспоринов-кислот, проводили сравнение последовательностей предсказанных белков с последовательностями известных ферментов, способных осуществлять ферментативный синтез Р-лактам-ных антибиотиков — пенициллин G—ацилазами (PGA) E. coli (UniProt P06875 ), Alcaligenes faecalis (Genbank AAE23977), Kluyvera cryocrescens (Genbank AAA25047), Providencia rettgeri (UniProt Q7WZI9), аминоэтил-гидролазой Xanthomonas citri (UniProt Q6YBS3), у-глутамилтранспептидазой Bacillus li-cheniformis (UniProt A9YTT0), глутарил—ацилазой Brevundimonas diminuta (UniProt Q9L5D6).
ДНК-манипуляции и компьютерные программы.
Определение нуклеотидных последовательностей ПЦР-фрагментов и плазмид проводили путем автоматического секвенирования на приборе ABI-Prizm 3100 DNA Sequencer с использованием набора Applera "Fluorescent Big dye Cycle sequencing kit" ("Life Technologies", США). Нуклеотидные последовательности анализировали с помощью пакета программ Vfector NTI8 "Life Technologies", США).
Конструирование вектора pMD0107. Ген CASA выделяли методом ПЦР на основании полученных данных о его первичной структуре. В качестве матрицы использовали хромосомную ДНК штамма E.coli ВКПМ B-10182, а в качестве прай-меров — олигонуклеотиды PGA1 GGTCATAT-GAAAAATAGAAATCGTATGATCGTGAACTG и PGA2 GGTCTCGAGTTATCTCTGAACGTGCAA-CACTTCCTGC, специфичные к 5'- и З'-концевым кодирующим последовательностям гена CASA. Для получения плазмиды, обеспечивающей в клетках E. coli синтез рекомбинантной CASA, использовали плазмиду pSVH0108, сконструированную ранее [21]. Выделенный фрагмент гидро-лизовали совместно рестриктазами NdeI/XhoI и встраивали в NdeI/XhoI вектор pSVH0108, получая плазмиду pMD0107. Скрининг на наличие инсер-ций у фрагмента, кодирующего ген CASA без ПЦР-мутаций, проводили секвенированием плазмидной ДНК pMD0107 с использованием праймеров: Т7пром 5'TAATACGACTCACTATAGGG3' и Т7терм 5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3', PGA3 CTAC-GATTTACCTGCACCAATG и PGA4_ CCATC-CCAACGTGTTAATGTT, специфичных к центральной части кодирующей последовательности гена.
Определение синтетазной активности CASA.
Для количественного определения активности в реакции синтеза модельного антибиотика — це-фазолина из ММТД-7-АЦК и METzAA использовали клетки штамма E. coli BL21(DE3)/pMD0107. Синтетазную реакцию проводили в 0.3 М Na-фосфатном буфере, рН 7.5, (объем реакционной смеси 10 мл) при 30°C в течение 15 мин с использованием такого количества биомассы, которая обеспечивала степень трансформации ММТД-7-АЦК в цефазолин (ЦЕЗ) не более 7.5%. Количество ЦЕЗ в реакционной смеси
определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в изократиче-ском режиме на колонке "Kromasil C18" или "Spherisorb ODS" ("Sigma-Aldrich", США) с использованием в качестве подвижной фазы, 28%-ный раствор метанола в 0.05 М фосфатно-аммонийном буфере, рН 4.0. Детектирование вели при длине волны 254 нм, используя инжектор хроматографа с дозирующей петлей 10 или 20 мкл; расход подвижной фазы 1 мл/мин; температура 30°С. Время удерживания ЦЕЗ составляло 7—8 мин. Полученные хроматограммы обсчитывали с помощью программы МультиХром версии 3.х. За единицу ферментативной (синте-тазной) активности принимали такое его количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоля ЦЕЗ за 1 мин в реакционной смеси, содержащей 0.059 ± 0.001 М ММТД-7-АЦК и 0.236 ± 0.004 М МЭТЗУК при начальном значении рН 7.50 ± 0.05 и температуре 30 ± 1°C. Для определения синтетазной активности готовили суспензию клеток в 0.1 М Na-фосфатном буфере, рН 7.5. Содержание влажной биомассы в реакционной смеси от в зависимости от уровня синтетазной активности образца — от 0.3 до 6.0 мг/мл, что обеспечивало возможность анализа препаратов с активностью от 80 до 10000 МЕ/г биомассы (влажной). Для расчета на сухую биомассу навески по 100—200 мг сушили до постоянного веса при
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.