ш
УДК (577.112.6 + 577.171.6):+612.014
СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПЕПТИД ИММУНОРФИН - КАК ИНСТРУМЕНТ ИССЛЕДОВАНИЯ НЕОПИОИДНОГО РЕЦЕПТОРА р-ЭНДОРФИНА
© 2010 г. Ю. А. Ковалицкая#, Е. В. Наволоцкая
Филиал Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290, Пущино, Московская обл., пр-т Науки, 6 Поступила в редакцию 15.05.2009 г. Принята к печати 22.06.2009 г.
В обзоре обобщены результаты исследования синтетического декапептида, аминокислотная последовательность которого соответствует фрагменту 364—373 тяжелой цепи иммуноглобулина О человека 8ЬТСЬУКОРУ (авторское название — иммунорфин). Особое внимание уделено взаимодействию иммунорфина с неопиоидным (нечувствительным к опиоидному антагонисту налоксону) рецептором в-эндорфина. Приводятся данные о распределении и функциях неопиоидного рецептора в-эндорфина в организме человека и животных, характеристики связывания иммунорфина с неопио-идным рецептором, полученные с помощью метода радиолигандного анализа.
Ключевые слова: в-эндорфин; неопиоидные сайты связывания; синтетические пептиды; иммунокомпе-тентные клетки; мембраны; зародыши.
ВВЕДЕНИЕ
При выделении р-эндорфина в экстракте плаценты человека был обнаружен полипептид с молекулярной массой 50 кДа, который при детальном анализе оказался тяжелой цепью иммуноглобулина О (1§О) [1]. Было установлено, что пептид, представляющий собой фрагмент 364—379 тяжелой цепи 1§О, гомологичен центральной части молекулы р-эндорфина на 60% (рис. 1). Хоук и сотр. [2] синтезировали этот пептид и показали, что он способен ин-гибировать связывание р-[1251]эндорфина с рецепторами головного мозга крысы.
В то же время было установлено, что р-эндор-фин взаимодействует не только с опиоидными рецепторами. Хазум с сотр. обнаружили, что специфическое связывание 1251-меченного р-[0-Л1а2]эн-дорфина с трансформированными Т-лимфоцитами человека ингибируется р-эндорфином и р-[0-Л1а2]эндорфином, однако на связывание не влияют аналоги энкефалина, р-липотропин, инсулин, глю-кагон, адренокортикотропный гормон, р-мелано-цитстимулирующий гормон, опиоидные агонисты и антагонисты [3]. Это открытие дало основание предположить наличие на лимфоцитах человека неизвестных специфических участков связывания р-эндорфина неопиоидной природы. До настоящего времени этот рецептор остается малоизученным.
Нами был синтезирован декапептид И-8ег-Ьеи-ТЬг-Су5-Ьеи-\а1-Ьу5-О1у-РИе-Туг-ОИ, назван-
Сокращения: Кй — константа диссоциации; К — константа ингибирования. # Автор для связи (тел.: (4967) 73-66-68; факс: (4967) 33-05-27; эл. почта: kova1itskaya@inbox.ru).
ный иммунорфином, соответствующий фрагменту 364—373 тяжелой цепи 1§О (рис. 1) [4]. Исследование рецепции иммунорфина показало, что он конкурирует с р-[1251]эндорфином за связывание с высокоаффинными рецепторами на перитонеальных макрофагах мыши (К = 2.5 ± 0.9 нМ), а также с [3Н]морфином за связывание с рецептором на ти-моцитах мыши (К = 2.7 ± 0.6 нМ) и на макрофагах мыши (К = 5.9 ± 0.7 нМ). Причем на связывание не влиял блокатор опиоидных рецепторов налоксон. Согласно полученным данным, на тимоцитах и пе-ритонеальных макрофагах мыши существуют рецепторы, которые взаимодействуют с р-эндорфи-ном и иммунорфином и не чувствительны к налок-сону.
Таким образом, было установлено, что иммунор-фин взаимодействует с неопиоидным рецептором р-эндорфина и может быть использован в качестве уникального инструмента для изучения этого неизвестного типа рецепторов р-эндорфина. Преимущества пептида очевидны: сравнительно небольшой размер молекулы удешевляет синтез и к тому же пептид не взаимодействует с опиоидными рецепторами. Изучение свойств и механизма действия им-мунорфина позволили нам охарактеризовать не-опиоидные рецепторы р-эндорфина и функции, которые он опосредует в организме млекопитающих.
1. Действие иммунорфина на иммунокомпетентные клетки
Нами были синтезированы фрагменты иммунорфина; при изучении полученных пептидов установлено, что самым коротким активным фрагмен-
Р-Эндорфин
Ни ДО (364-377) Иммунорфин
Пентарфин Циклопентарфин
1 10 20 30
УООШТБЕКвдТРЪУТЬР^АЖКУНККОО
Рис. 1. Аминокислотные последовательности Р-эндорфина, фрагмента (364—377) тяжелой цепи 1^0, иммунорфина, пентарфина и циклопентарфина. Совпадающие аминокислотные остатки выделены жирным шрифтом.
том оказался иммунорфин-(6—10) (авторское название — пентарфин), а также его циклический аналог — циклопентарфин (рис. 1). Синтезированные фрагменты иммунорфина были использованы для изучения локализации неопиоидного рецептора р-эндорфина и функций, осуществляемых посредством связывания пептидов с этим рецептором. Поскольку аминокислотная последовательность иммунорфина подобна центральной части молекулы р-эндорфина, в исследованиях мы опирались на известные свойства гормона. Установлено, что р-эндорфин оказывает модулирующее действие на клетки иммунной системы [5], поэтому в первую очередь было изучено влияние иммунорфина на иммуноциты.
Мы изучили влияние р-эндорфина, иммунорфина, [Ме^энкефалина и налоксона на пролиферацию Т-лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, индуцированную конканавалином А. Оказалось, что р-эндорфин и иммунорфин в диапазоне концентраций 10-6—10-12 М стимулируют пролиферацию Т-лимфоцитов на 50—100%, а [Ме^]эн-кефалин и налоксон были не активны. Стимулирующее действие р-эндорфина и иммунорфина на пролиферацию Т-лимфоцитов не ингибировалось налоксоном [6].
Изучение связывания [1251] иммунорфина с Т-лимфоцитами показало, что он взаимодействует с высокоаффинными сайтами связывания, нечувствительными к налоксону. График Скэтчарда, описывающий это взаимодействие, имеет вид прямой линии, что свидетельствует о наличии одного типа рецепторов для иммунорфина на поверхности Т-лимфоцитов, а величина Хй, равная 7.0 ± 0.3 нМ, говорит о высоком сродстве лиганда к рецептору (рис. 2) [6]. Немеченый р-эндорфин полностью ин-гибировал специфическое связывание [1251]имму-норфина с налоксоннечувствительными сайтами связывания на Т-лимфоцитах (К = 1.1 ± 0.2 нМ). Точно так же немеченый иммунорфин полностью ингибировал специфическое связывание р-[125!]эн-
дорфина с нечувствительными к налоксону рецепторами Т-лимфоцитов (К = 0.6 ± 0.1 нМ) [7].
Таким образом было установлено, что иммунор-фин и р-эндорфин взаимодействуют с общим нечувствительным к налоксону сайтом связывания на Т-лимфоцитах и увеличивают индуцированную конканавалином А пролиферацию этих клеток. Иммунорфин был более активен, чем гормон.
Чтобы установить минимальный фрагмент пептида, необходимый для связывания с неопиоидным рецептором р-эндорфина, была изучена способность фрагментов иммунорфина ингибировать специфическое связывание р-[1251]эндорфина с Т-лим-фоцитами периферической крови здоровых доноров. Протестированные фрагменты иммунорфина, так же как и сам иммунорфин, обладали ингибиру-ющими свойствами в присутствии налоксона. Константы ингибирования (нМ) составили: для пентарфина — 15, иммунорфина-(5—10) — 8.0, иммунор-фина-(4—10) — 3.4, иммунорфина-(3—10) — 2.2. Минимальным фрагментом иммунорфина, способным к ингибированию, оказался пентарфин, значение Кй, характеризующее специфическое связывание [1251]пентарфина с рецептором составило 36.3 ± 0.5 нМ. Сравнительный анализ конкурентной способности фрагментов иммунорфина также показал, что максимальной ингибирующей активностью, а значит и наибольшим сродством к рецептору, обладает иммунорфин [8, 9].
Следует подчеркнуть, что поскольку иммунор-фин не идентичен, а только подобен (на 50%) фрагменту (10—19) р-эндорфина, нельзя сделать однозначный вывод о том, что именно этот участок в молекуле гормона обеспечивает его связывание с рецепторами Т-лимфоцитов. Тем более что литературные данные изучения влияния фрагментов р-эн-дорфина на пролиферацию Т-лимфоцитов свидетельствуют о том, что максимальной пролифератив-ной активностью обладает фрагмент (6—23) [10, 11].
Таким образом, с помощью синтетического пептида иммунорфина мы показали наличие не-
Kd = 1.3 нМ
0.2 0.3 B, нМ
0.4 0.5 B, нМ
Рис. 2. Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [1251]иммунорфина с Т-лимфоцитами в отсутствие (а, 1) и в присутствии 1 мкМ налоксона (а, 2); [3Н]иммунорфина с клетками Juгkat (б); [1251]пентарфина с пери-тонеальными макрофагами мыши (в); [3Н]иммунорфина с перитонеальными макрофагами мыши (г). В и F — молярные концентрации связанного и свободного меченого пептида.
опиоидных рецепторов ß-эндорфина на Т-лимфо-цитах периферической крови здоровых доноров. Взаимодействуя с этим рецептором, ß-эндорфин и иммунорфин стимулируют пролиферацию индуцированных конканавалином А Т-лимфоцитов. Наибольшим сродством к рецептору из всех протестированных фрагментов иммунорфина обладает сам иммунорфин. Константа диссоциации ли-ганд-рецепторного комплекса составила 7.0 нМ. Размерность константы диссоциации наномоляр-ная, что говорит о высоком сродстве иммунорфи-на к неопиоидному рецептору ß-эндорфина, и совпадает с литературными данными (таблица).
Лейкемические клеточные линии являются модельными системами для изучения регуляции лим-фо- и миелопоэза. Мы изучили влияние ß-эндор-фина и иммунорфина на рост различных клеточных линий человека, чтобы установить наличие неопио-идных рецепторов гормона на их поверхности. Оказалось, что исследуемые пептиды стимулировали
рост клеток Т-лимфобластных линий Jurkat (на 150-170%) и МТ-4 (на 130%), причем их действие не блокировалось налоксоном. р-Эидорфин и им-мунорфин в диапазоне физиологических концентраций не оказывали влияния на рост В-лимфоб-ластной линии человека RPMI-1788, острой про-миелоцитарной лейкемии ИЬ-60 и хронической миелоидной лейкемии К-562. Было обнаружено, что иммунорфин в концентрации 10-8-10-6 М увеличивал скорость деления клеток диффузной ги-стиоцитарной лимфомы и-937 на 30%. В то же время р-эндорфин в дозе 10-8-10-7 М вызывал 40%-ное увеличение роста данной клеточной линии [26]. Можно предположить, что на поверхности клеток линий RPMI-1788, ИЬ-60 и и-937 не экс-прессируются рецепторы, через которые пептиды могли бы опосредовать ростовой сигнал, поэтому р-эндорфин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.