научная статья по теме СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПЕПТИД KKRR, СООТВЕТСТВУЮЩИЙ ФРАГМЕНТУ 15–18 АДРЕНОКОРТИКОТРОПНОГО ГОРМОНА ЧЕЛОВЕКА, ЯВЛЯЕТСЯ ЕГО АНТАГОНИСТОМ Химия

Текст научной статьи на тему «СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПЕПТИД KKRR, СООТВЕТСТВУЮЩИЙ ФРАГМЕНТУ 15–18 АДРЕНОКОРТИКОТРОПНОГО ГОРМОНА ЧЕЛОВЕКА, ЯВЛЯЕТСЯ ЕГО АНТАГОНИСТОМ»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2008, том 34, № 1, с. 29-35

УДК 517.112.6+577.175.53

СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПЕПТИД KKRR, СООТВЕТСТВУЮЩИЙ ФРАГМЕНТУ 15-18 АДРЕНОКОРТИКОТРОПНОГО ГОРМОНА ЧЕЛОВЕКА, ЯВЛЯЕТСЯ ЕГО АНТАГОНИСТОМ

© 2008 г. Ю. А. Ковалицкая*, А. А. Колобов**, Е. А. Кампе-Немм**, Ю. А. Золотарев***, В. В. Юровский****, В. Б. Садовников*, В. М. Липкин*, Е. В. Наволоцкая*#

*Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290,

Московская обл., г. Пущино, просп. Науки, 6; **ГНЦГосударственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов,

Санкт-Петербург; ***Институт молекулярной генетики РАН, Москва; ****Факультет нейрохирургии университета Мэриленд, Балтимор, США Поступила в редакцию 08.12.2006 г. Принята к печати 25.01.2007 г.

Получены меченные тритием синтетические фрагменты адренокортикотропного гормона (ACTH) человека - [3H]ACTH-(11-24) и [3H]ACTH-(15-18), c удельной активностью 22 и 26 Ки/ммоль соответственно. Показано, что [3H] ACTH-(11-24) с высоким сродством и высокой специфичностью связывается с мембранами коры надпочечников крысы (Kd 1.8 ± 0.1 нМ). Синтезировано 29 фрагментов ACTH-(11-24) и исследована их способность ингибировать специфическое связывание [3H]ACTH-(11-24) с мембранами. Обнаружено, что самым коротким активным пептидом является ACTH-(15-18) (KKRR) (Ki 2.3 ± 0.2 нМ). Показано, что [3H]ACTH-(15-18) с высоким сродством связывается с мембранами коры надпочечников крысы (Kd 2.1 ± 0.1 нМ). Специфическое связывание [3H] ACTH-(15-18) с мембранами на 100% ингибировал немеченый ACTH-(11-24) (Ki 2.0 ± 0.1 мМ). В диапазоне концентраций 1-1000 нМ ACTH-(15-18) не влиял на активность аденилатциклазы адрено-кортикальных мембран. Таким образом, фрагмент ACTH-(15-18) является антагонистом ACTH.

Ключевые слова: адренокортикотропный гормон (ACTH), пептиды, рецепторы; аденилатцикла-за; кора надпочечников.

ВВЕДЕНИЕ

Основная функция ACTH состоит в стимуляции синтеза и секреции глюкокортикоидов клетками пучковой и сетчатой зон коры надпочечников. Чувствительность клеток коры к ACTH зависит от экспрессии и функции G-белок-сопряженного рецептора (меланокортин-2-рецептора, MC2R), принадлежащего к подсемейству меланокортиновых рецепторов [1-4]. Связывание гормона с MC2R приводит к увеличению активности аденилатциклазы и, как следствие, к активации протеинкиназы A [5-7]. Капас и соавт. исследовали связывание фрагментов ACTH с клонированным мышиным рецептором гормона, экспрессированным в человеческих клетках HeLa [8]. Согласно полученным ими данным, фрагмент ACTH-(11-24) активно конкурирует с 125Ьмеченным ACTH за связывание

Сокращения: ACTH - адренокортикотропный гормон; MC2R - меланокортин-2-рецептор; РАМ - фенациламидо-метил; SEM - стандартная ошибка среднего. # Автор для связи (тел.: (4967) 73-66-68; факс: (4967) 33-05-27; эл. почта: navolots@fibkh.serpukhov.su).

(ГС50 ~ 1 нМ), но, в отличие от полноразмерного гормона, не обладает способностью активировать аде-нилатциклазу, т. е. проявляет свойства антагониста.

Цель настоящей работы - исследование способности немеченых синтетических фрагментов ACTH-(11-24)-пептида ингибировать специфическое связывание [3H]ACTH-(11-24) с мембранами коры надпочечников крысы; определение фрагмента наименьшей длины, способного с высоким сродством связываться с рецептором ACTH, и изучение влияния соответствующего пептида на активность аденилатциклазы адренокортикальных мембран.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ACTH-(1-24), минимальный фрагмент ACTH, необходимый для проявления гормоном полной активности; его последовательность без десяти С-концевых аминокислотных остатков соответствует первичной структуре а-меланоцитстимули-рующего гормона (а-MSH) (рис. 1). Сравнительный анализ первичной структуры ACTH позвоночных показывает, что участок молекулы 15-24

1 1(1 2(1 ACTH-(1-24) . ■■■.■■ ■ : KKRRPVKVYP

] ш

a-MSH ir-.'-rsH^fc-p-w.-.K F V r.:.

Рис. 1. Сравнение аминокислотных последовательностей АСТН-(1-24)-пептида и а-М8Ы человека. Фрагмент АСТН-(15-24) выделен жирным шрифтом.

эволюционно высоко консервативен. Коста и со-авт. [9] получили аналоги АСТИ-(1-24)-пептида с аминокислотными заменами в области 15-24 и оценили их активность in vitro и in vivo (рис. 2). На основании полученных результатов авторы сделали заключение, что участок 15-18 (KKRR) в молекуле ACTH необходим как для связывания с рецептором, так и для последующей активации адени-латциклазы. Удивительным оказалось то, что аналог с заменой пяти С-концевых аминокислотных остатков 20-24 (VKVYP) на остатки Ala был в 1.5 раза активнее АСТН-(1-24)-пептида с природной последовательностью in vivo (но не in vitro). По мнению Коста и соавт., участок 20-24 молекулы ACTH не вовлечен в связывание гормона с рецептором, но важен для формирования пространственной структуры, обеспечивающей оптимальный уровень стабильности ACTH в крови.

По данным Капас и соавт. [8], ACTH-(11-24) действует как антагонист рецептора: конкурирует с 1251-меченным ACTH за связывание с клонированным рецептором (IC50 ~ 1 нМ), но, в отличие от ACTH, не активирует аденилатциклазу. Мы получили пептид [3H]ACTH-(11-24) (уд. акт. 22 Ки/моль) и изучили его связывание с мембранами, выделенными из коры надпочечников крысы. Эксперименты показали, что в выбранных нами условиях (см. раздел "Эксперимент. часть") [3H]ACTH-(11-24)-пептид специфически связывается с мембранами коры надпочечников крысы (рис. 3). Из графиков общего (1), специфического (2) и неспецифического (3) связывания [3H]ACTH-(11-24) с мембранами от времени инкубации видно, что динамическое равновесие в системе меченый пептид-рецептор устанавливалось примерно через 1 ч и сохранялось не менее 2 ч. Поэтому для определения величины равновесной константы диссоциации (K) реакцию связывания [3H] ACTH-(11-24) с мембранами проводили в течение 1 ч. Неспецифическое связывание [3H]ACTH-(11-24) в этих условиях составляло 6.4 ± 0.8% от величины его общего связывания.

График Скэтчарда (1), приведенный на рис. 4, показывает, что пептид [3H]ACTH-(11-24) связывается с одним типом высокоаффинных рецепторов на мем-

Рис. 2. Аминокислотная последовательность и активность (%) аналогов АСТН-(1-24), полученных Коста и соавт. По данным работы [9].

(а)

Связывание [3H]ACTH-(11-24), имп./мин 30000 г

25000 -

20000

15000

10000 -

5000

Связывание [3H]ACTH-(15-18), имп./мин 30000

25000 20000 15000 10000 -5000

20

40

60

80

100 120 Время, мин

Рис. 3. Зависимость общего (1), специфического (2) и неспецифического (3) связывания пептидов [3Н]АСТН-(11-24) (а) и [3Н]АСТН-(15-18) (б) с мембранами коры надпочечников крысы от времени инкубации при 4°С. Величину специфического связывания меченого пептида определяли как разность между его общим и неспецифическим связыванием.

1

2

3

0

бранах коры надпочечников крысы (К комплекса [3H]ACTH-(11-24)-рецептор составила 1.8 ± 0.1 нМ, Втах - 28 ± 0.2 пмоль/мг белка). Для характеристики специфичности связывания в качестве потенциальных конкурентов [3H]ACTH-(11-24)-пептида были протестированы немеченые пептиды: ACTH-(1-24) (в качестве положительного контроля), АСта-(4-10), соматостатин, Р-эндорфин и [Met5]энкефалин (как отрицательный контроль). Результаты экспериментов, представленные в табл. 1, показывают, что из них только ACTH-(1-24) обладал способностью ингибировать связывание [3H]ACTH-(11-24) с мембранами (К 1.7 ± 0.1 нМ). Остальные пептиды были не активны. Таким образом, [3H]ACTH-(11-24) с высоким сродством и высокой специфичностью связывается с рецептором ACTH мембран коры надпочечников крысы.

Для оценки сродства к рецептору ACTH мембран коры надпочечников немеченых фрагментов АСта-(11-24) (табл. 1) была изучена способность каждого из них ингибировать специфическое связывание [3Ы] ACTH-(11-24) с мембранами. Оказалось, что высокой ингибирующей способностью обладают только те фрагменты ACTH-(11-24), которые содержат последовательность КККЯ (№ 29, фрагмент 15-18), а также тетрапептид ККкР (№ 26, фрагмент 16-19). Ингибирующая активность остальных пептидов была крайне низкой (К > 1 мкМ). Тетрапептиды ККИИ и КИИР были самыми короткими фрагментами ACTH-(11-24), активно ингибирующими связывание [3H]ACTH-(11-24) с адренокортикальными мембранами (К 2.3 ± 0.2 и 2.0 ± 0.2 нМ) (табл. 1).

Для характеристики связывания пептида ACTH-(15-l8) с мембранами коры надпочечников крысы в прямом эксперименте был получен меченый [3Ы]ACTЫ-(15-18), уд. акт. 26 Ки/моль (см. раздел "Эксперимент. часть"). Зависимость общего (1), специфического (2) и неспецифического (3) связывания [3H]ACTH-(15-18) с мембранами от времени инкубации (рис. 36) аналогична таковой для [3H]ACTH-(11-24) (рис. 3а): динамическое равновесие в системе меченый пептид-рецептор устанавливалось через 1 ч и сохранялось в течение 2 ч. Поэтому в дальнейшем реакцию связывания [3Ы]ACTЫ-(15-18) с мембранами проводили в течение 1 ч. Неспецифическое связывание [3Ы]АСТЫ-(15-18) составляло 6.4 ± 0.6% от величины его общего связывания.

Анализ специфического связывания [3Ы]АСта-(15-18) с мембранами коры надпочечников в координатах Скэтчарда (рис. 4, график 2) показал, что меченый пептид с высоким сродством связывается с одним типом рецепторов (К(1 2.1 ± 0.1 нМ, Втах = = 2.6 ± 0.2 пмоль/мг белка). Исследование специ-

B/F

B, нМ

Рис. 4. Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [3H]ACTH-(1-24) (1) и [3H]ACTH-(15-18) (2) с мембранами коры надпочечников крысы (B и F - молярные концентрации связанного и свободного меченого пептида соответственно).

фичности связывания показало, только ACTH-(1-24) и ACTH-( 11-24) способны вытеснять [3H]ACTH-(15-18) из комплекса с рецептором К 1.9 ± 0.1 и 2.0 ± 0.1 нМ, табл. 2). Протестированные параллельно немеченые ACTH-(4-10), соматостатин, Р-эндорфин и [Ме^энкефалин были неактивны, K >10 мкМ.

Исследование влияния пептидов ACTH-(1-24), ACTH-(11-24) и ACTH-(15-18) на активность адени-латциклазы мембран коры надпочечников крысы показало, что в отличие от ACTH-(1-24), активирующего фермент, его фрагменты 11-24 и 15-18 в диапазоне концентраций 1-1000 нМ не влияли на ферментну

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком