БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2008, том 34, № 1, с. 29-35
УДК 517.112.6+577.175.53
СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПЕПТИД KKRR, СООТВЕТСТВУЮЩИЙ ФРАГМЕНТУ 15-18 АДРЕНОКОРТИКОТРОПНОГО ГОРМОНА ЧЕЛОВЕКА, ЯВЛЯЕТСЯ ЕГО АНТАГОНИСТОМ
© 2008 г. Ю. А. Ковалицкая*, А. А. Колобов**, Е. А. Кампе-Немм**, Ю. А. Золотарев***, В. В. Юровский****, В. Б. Садовников*, В. М. Липкин*, Е. В. Наволоцкая*#
*Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290,
Московская обл., г. Пущино, просп. Науки, 6; **ГНЦГосударственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов,
Санкт-Петербург; ***Институт молекулярной генетики РАН, Москва; ****Факультет нейрохирургии университета Мэриленд, Балтимор, США Поступила в редакцию 08.12.2006 г. Принята к печати 25.01.2007 г.
Получены меченные тритием синтетические фрагменты адренокортикотропного гормона (ACTH) человека - [3H]ACTH-(11-24) и [3H]ACTH-(15-18), c удельной активностью 22 и 26 Ки/ммоль соответственно. Показано, что [3H] ACTH-(11-24) с высоким сродством и высокой специфичностью связывается с мембранами коры надпочечников крысы (Kd 1.8 ± 0.1 нМ). Синтезировано 29 фрагментов ACTH-(11-24) и исследована их способность ингибировать специфическое связывание [3H]ACTH-(11-24) с мембранами. Обнаружено, что самым коротким активным пептидом является ACTH-(15-18) (KKRR) (Ki 2.3 ± 0.2 нМ). Показано, что [3H]ACTH-(15-18) с высоким сродством связывается с мембранами коры надпочечников крысы (Kd 2.1 ± 0.1 нМ). Специфическое связывание [3H] ACTH-(15-18) с мембранами на 100% ингибировал немеченый ACTH-(11-24) (Ki 2.0 ± 0.1 мМ). В диапазоне концентраций 1-1000 нМ ACTH-(15-18) не влиял на активность аденилатциклазы адрено-кортикальных мембран. Таким образом, фрагмент ACTH-(15-18) является антагонистом ACTH.
Ключевые слова: адренокортикотропный гормон (ACTH), пептиды, рецепторы; аденилатцикла-за; кора надпочечников.
ВВЕДЕНИЕ
Основная функция ACTH состоит в стимуляции синтеза и секреции глюкокортикоидов клетками пучковой и сетчатой зон коры надпочечников. Чувствительность клеток коры к ACTH зависит от экспрессии и функции G-белок-сопряженного рецептора (меланокортин-2-рецептора, MC2R), принадлежащего к подсемейству меланокортиновых рецепторов [1-4]. Связывание гормона с MC2R приводит к увеличению активности аденилатциклазы и, как следствие, к активации протеинкиназы A [5-7]. Капас и соавт. исследовали связывание фрагментов ACTH с клонированным мышиным рецептором гормона, экспрессированным в человеческих клетках HeLa [8]. Согласно полученным ими данным, фрагмент ACTH-(11-24) активно конкурирует с 125Ьмеченным ACTH за связывание
Сокращения: ACTH - адренокортикотропный гормон; MC2R - меланокортин-2-рецептор; РАМ - фенациламидо-метил; SEM - стандартная ошибка среднего. # Автор для связи (тел.: (4967) 73-66-68; факс: (4967) 33-05-27; эл. почта: navolots@fibkh.serpukhov.su).
(ГС50 ~ 1 нМ), но, в отличие от полноразмерного гормона, не обладает способностью активировать аде-нилатциклазу, т. е. проявляет свойства антагониста.
Цель настоящей работы - исследование способности немеченых синтетических фрагментов ACTH-(11-24)-пептида ингибировать специфическое связывание [3H]ACTH-(11-24) с мембранами коры надпочечников крысы; определение фрагмента наименьшей длины, способного с высоким сродством связываться с рецептором ACTH, и изучение влияния соответствующего пептида на активность аденилатциклазы адренокортикальных мембран.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ACTH-(1-24), минимальный фрагмент ACTH, необходимый для проявления гормоном полной активности; его последовательность без десяти С-концевых аминокислотных остатков соответствует первичной структуре а-меланоцитстимули-рующего гормона (а-MSH) (рис. 1). Сравнительный анализ первичной структуры ACTH позвоночных показывает, что участок молекулы 15-24
1 1(1 2(1 ACTH-(1-24) . ■■■.■■ ■ : KKRRPVKVYP
] ш
a-MSH ir-.'-rsH^fc-p-w.-.K F V r.:.
Рис. 1. Сравнение аминокислотных последовательностей АСТН-(1-24)-пептида и а-М8Ы человека. Фрагмент АСТН-(15-24) выделен жирным шрифтом.
эволюционно высоко консервативен. Коста и со-авт. [9] получили аналоги АСТИ-(1-24)-пептида с аминокислотными заменами в области 15-24 и оценили их активность in vitro и in vivo (рис. 2). На основании полученных результатов авторы сделали заключение, что участок 15-18 (KKRR) в молекуле ACTH необходим как для связывания с рецептором, так и для последующей активации адени-латциклазы. Удивительным оказалось то, что аналог с заменой пяти С-концевых аминокислотных остатков 20-24 (VKVYP) на остатки Ala был в 1.5 раза активнее АСТН-(1-24)-пептида с природной последовательностью in vivo (но не in vitro). По мнению Коста и соавт., участок 20-24 молекулы ACTH не вовлечен в связывание гормона с рецептором, но важен для формирования пространственной структуры, обеспечивающей оптимальный уровень стабильности ACTH в крови.
По данным Капас и соавт. [8], ACTH-(11-24) действует как антагонист рецептора: конкурирует с 1251-меченным ACTH за связывание с клонированным рецептором (IC50 ~ 1 нМ), но, в отличие от ACTH, не активирует аденилатциклазу. Мы получили пептид [3H]ACTH-(11-24) (уд. акт. 22 Ки/моль) и изучили его связывание с мембранами, выделенными из коры надпочечников крысы. Эксперименты показали, что в выбранных нами условиях (см. раздел "Эксперимент. часть") [3H]ACTH-(11-24)-пептид специфически связывается с мембранами коры надпочечников крысы (рис. 3). Из графиков общего (1), специфического (2) и неспецифического (3) связывания [3H]ACTH-(11-24) с мембранами от времени инкубации видно, что динамическое равновесие в системе меченый пептид-рецептор устанавливалось примерно через 1 ч и сохранялось не менее 2 ч. Поэтому для определения величины равновесной константы диссоциации (K) реакцию связывания [3H] ACTH-(11-24) с мембранами проводили в течение 1 ч. Неспецифическое связывание [3H]ACTH-(11-24) в этих условиях составляло 6.4 ± 0.8% от величины его общего связывания.
График Скэтчарда (1), приведенный на рис. 4, показывает, что пептид [3H]ACTH-(11-24) связывается с одним типом высокоаффинных рецепторов на мем-
Рис. 2. Аминокислотная последовательность и активность (%) аналогов АСТН-(1-24), полученных Коста и соавт. По данным работы [9].
(а)
Связывание [3H]ACTH-(11-24), имп./мин 30000 г
25000 -
20000
15000
10000 -
5000
Связывание [3H]ACTH-(15-18), имп./мин 30000
25000 20000 15000 10000 -5000
20
40
60
80
100 120 Время, мин
Рис. 3. Зависимость общего (1), специфического (2) и неспецифического (3) связывания пептидов [3Н]АСТН-(11-24) (а) и [3Н]АСТН-(15-18) (б) с мембранами коры надпочечников крысы от времени инкубации при 4°С. Величину специфического связывания меченого пептида определяли как разность между его общим и неспецифическим связыванием.
1
2
3
0
бранах коры надпочечников крысы (К комплекса [3H]ACTH-(11-24)-рецептор составила 1.8 ± 0.1 нМ, Втах - 28 ± 0.2 пмоль/мг белка). Для характеристики специфичности связывания в качестве потенциальных конкурентов [3H]ACTH-(11-24)-пептида были протестированы немеченые пептиды: ACTH-(1-24) (в качестве положительного контроля), АСта-(4-10), соматостатин, Р-эндорфин и [Met5]энкефалин (как отрицательный контроль). Результаты экспериментов, представленные в табл. 1, показывают, что из них только ACTH-(1-24) обладал способностью ингибировать связывание [3H]ACTH-(11-24) с мембранами (К 1.7 ± 0.1 нМ). Остальные пептиды были не активны. Таким образом, [3H]ACTH-(11-24) с высоким сродством и высокой специфичностью связывается с рецептором ACTH мембран коры надпочечников крысы.
Для оценки сродства к рецептору ACTH мембран коры надпочечников немеченых фрагментов АСта-(11-24) (табл. 1) была изучена способность каждого из них ингибировать специфическое связывание [3Ы] ACTH-(11-24) с мембранами. Оказалось, что высокой ингибирующей способностью обладают только те фрагменты ACTH-(11-24), которые содержат последовательность КККЯ (№ 29, фрагмент 15-18), а также тетрапептид ККкР (№ 26, фрагмент 16-19). Ингибирующая активность остальных пептидов была крайне низкой (К > 1 мкМ). Тетрапептиды ККИИ и КИИР были самыми короткими фрагментами ACTH-(11-24), активно ингибирующими связывание [3H]ACTH-(11-24) с адренокортикальными мембранами (К 2.3 ± 0.2 и 2.0 ± 0.2 нМ) (табл. 1).
Для характеристики связывания пептида ACTH-(15-l8) с мембранами коры надпочечников крысы в прямом эксперименте был получен меченый [3Ы]ACTЫ-(15-18), уд. акт. 26 Ки/моль (см. раздел "Эксперимент. часть"). Зависимость общего (1), специфического (2) и неспецифического (3) связывания [3H]ACTH-(15-18) с мембранами от времени инкубации (рис. 36) аналогична таковой для [3H]ACTH-(11-24) (рис. 3а): динамическое равновесие в системе меченый пептид-рецептор устанавливалось через 1 ч и сохранялось в течение 2 ч. Поэтому в дальнейшем реакцию связывания [3Ы]ACTЫ-(15-18) с мембранами проводили в течение 1 ч. Неспецифическое связывание [3Ы]АСТЫ-(15-18) составляло 6.4 ± 0.6% от величины его общего связывания.
Анализ специфического связывания [3Ы]АСта-(15-18) с мембранами коры надпочечников в координатах Скэтчарда (рис. 4, график 2) показал, что меченый пептид с высоким сродством связывается с одним типом рецепторов (К(1 2.1 ± 0.1 нМ, Втах = = 2.6 ± 0.2 пмоль/мг белка). Исследование специ-
B/F
B, нМ
Рис. 4. Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [3H]ACTH-(1-24) (1) и [3H]ACTH-(15-18) (2) с мембранами коры надпочечников крысы (B и F - молярные концентрации связанного и свободного меченого пептида соответственно).
фичности связывания показало, только ACTH-(1-24) и ACTH-( 11-24) способны вытеснять [3H]ACTH-(15-18) из комплекса с рецептором К 1.9 ± 0.1 и 2.0 ± 0.1 нМ, табл. 2). Протестированные параллельно немеченые ACTH-(4-10), соматостатин, Р-эндорфин и [Ме^энкефалин были неактивны, K >10 мкМ.
Исследование влияния пептидов ACTH-(1-24), ACTH-(11-24) и ACTH-(15-18) на активность адени-латциклазы мембран коры надпочечников крысы показало, что в отличие от ACTH-(1-24), активирующего фермент, его фрагменты 11-24 и 15-18 в диапазоне концентраций 1-1000 нМ не влияли на ферментну
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.