УДК (577.112.6+577.171.6):612.825;612.112.94
СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПЕПТИД ОКТАРФИН TPLVTLFK - СЕЛЕКТИВНЫЙ АГОНИСТ НЕОПИОИДНОГО РЕЦЕПТОРА ß-ЭНДОРФИНА
© 2011 г. Ю. Н. Некрасова, Е. В. Наволоцкая*
Филиал Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, просп. Науки, д. 6, г. Пущино, Московская обл., 142290; *электронная почта: navolotskaya@fibkh.serpukhov.su Поступила в редакцию 27.05.2011 г.
Синтезированы пептид TPLVTLFK, аминокислотная последовательность которого соответствует фрагменту 12-19 ß-эндорфина (авторское название — октарфин), и его аналоги (LPLVTLFK, TLLVTLFK, TPLVLLFK, TPLVTLLK, TPLVTLFL). Получен меченный тритием октарфин ([3Н]ок-тарфин, уд. активность 28 Ки/моль) и изучено его связывание с синаптическими мембранами коры головного мозга крысы и перитонеальными макрофагами мыши. Установлено, что [3Н]октарфин связывается с мембранами головного мозга крысы и макрофагами мыши с высокой аффинностью (Kd = 2.6 ± 0.2 и 2.3 ± 0.2 нМ соответственно) и специфичностью. Специфическое связывание [3Н]октарфина с мембранами головного мозга и макрофагами ингибировали немеченые ß-эндор-фин (K = 2.4 ± 0.2 и 2.7 ± 0.2 нМ соответственно) и селективный агонист неопиоидного рецептора ß-эндорфина синтетический пептид иммунорфин (SLTCLVKGFY) (Ki = 2.9 ± 0.2 и 2.4 ± 0.2 нМ соответственно) и не ингибировали немеченые налоксон, а-эндорфин, у-эндорфин и [Ме^]энкефа-лин (K > 10 мкМ). Ингибирующая активность немеченых аналогов октарфина была в 100 и более раз ниже, чем ингибирующая активность немеченого октарфина Показано, что октарфин стимулирует активность иммунокомпетентных клеток мыши in vitro: при концентрации 1 нМ он увеличивал способность перитонеальных макрофагов переваривать клетки вирулентного штамма Salmonella ty-phimurium 415 in vitro. Таким образом, октарфин является селективным агонистом неопиоидного (нечувствительного к антагонисту опиоидных рецепторов налоксону) рецептора ß-эндорфина си-наптических мембран коры головного мозга крысы и перитонеальных макрофагов мыши.
Ключевые слова: ß-эндорфин, налоксон, пептиды, рецепторы, головной мозг, иммунная система.
Известно, что р-эндорфин — это пептидный гормон, наиболее активный и полифункциональный представитель семейства опиоидных пептидов [1]. р-Эндорфин преимущественно взаимодействует с ц- и 5-, а по отдельным данным и с к-опиоидными рецепторами [2]. Неопиоидный рецептор р-эндорфина был открыт Хейзумом и со-авт. в 1979 г. Этот рецептор не связывал налоксон, циклазоцин, морфин, [Ме^энкефалин, [Ьеи5]эн-кефалин, а-эндорфин, р-липотропин, а-мелано-цитстимулирующий гормон (а-М8И), кортико-тропин (АКТГ), инсулин и глюкагон [3].
В 1980 г. в составе тяжелой цепи иммуноглобулина О человека (1§О) обнаружены АКТГ- и р-эндорфинподобные последовательности [4]. Хоук и соавт. синтезировали тетрадекапептид 8ЕГСЬУКОРУР8В1, соответствующий фрагменту 364—379 СИ3 домена тяжелой цепи 1§О, и показали, что он способен ингибировать связывание 1251-меченного р-эндорфина с рецепторами мембран головного мозга крысы [5].
Нами был синтезирован и исследован р-эн-дорфинподобный декапептид ВЬТСЕУКОБУ (авторское название — иммунорфин), соответствующий последовательности 364—373 тяжелой цепи
IgG(1-4) человека [6]. Экспериментально показано, что меченный тритием иммунорфин с высоким сродством и специфичностью связывается с неопиоидным рецептором р-эндорфина T-лим-фоцитов человека [7], перитонеальных макрофагов мыши, синаптических мембран головного мозга крысы [8, 9], а также линии Jurkat T-лим-фобластов человека [10]. Показано, что иммунор-фин увеличивает индуцированную митогеном пролиферацию T-лимфоцитов человека in vitro, активирует перитонеальные макрофаги мыши in vitro и in vivo, стимулирует рост T-лимфобласт-ных линий Jurkat и MT-4 человека, ингибирует активность аденилатциклазы мембран коры надпочечников крысы и подавляет секрецию глюко-кортикоидов из надпочечников в кровь, стимулирует процессы клеточного деления ранних эмбрионов мыши и образование зрелых бластоцист in vitro [11]. Исследование распределения неопиоидного рецептора p-эндорфина в организме крысы показало, что он представлен на клетках иммунной (макрофаги и лимфоциты), нервной (синаптиче-ские мембраны головного мозга), эндокринной (мембраны коры надпочечников) и сердечно-сосудистой (мембраны миокарда) систем [12].
Недавно нами с целью определения фрагмента p-эндорфина наименьшей длины, способного с высоким сродством связываться с неопиоидным рецептором, была синтезирована панель фрагментов p-эндорфина и исследована способность каждого из них ингибировать специфическое связывание [3Н]иммунорфина с перитонеальны-ми макрофагами мыши. Оказалось, что ингиби-рующая способность фрагмента 12—19 р-эндор-фина (K = 3.1 ± 0.3 нМ) близка к ингибирующей способности целой молекулы p-эндорфина (Ki = = 2.9 ± 0.2 нМ). Был сделан вывод, что синтетический пептид TPLVTLFK, соответствующий последовательности 12—19 p-эндорфина (авторское название — октарфин), это самый короткий фрагмент гормона, который обладает практически таким же сродством к неопиоидному рецептору, как иммунорфин и р-эндорфин [13, 14].
Цель настоящей работы — изучить связывание [3Н]октарфина с синаптическими мембранами коры головного мозга крысы, перитонеальными макрофагами мыши и охарактеризовать эффекты, возникающие при связывании октарфина с перитонеальными макрофагами мыши.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали [Мй5]энкефалин, ^еи5]энкефалин, p-эндорфин, налоксон, тафт-син, среды для культивирования клеток, феталь-ную сыворотку теленка (Sigma, США); Z-глута-мин и HEPES (ICN, США); оксид алюминия (Al2O3) (Sigma, США); пенициллин и стрептомицин (Gibco, США); агарозу, сахарозу, бычий сывороточный альбумин (БСА), ЕЭТА, EGТА, трис, фенилметилсульфонилфторид (PMSF), азид натрия (NaN3) (Serva, Германия), сцинтилляцион-ный счетчик LS 5801 (Beckman, США). N-метил-пирролидон, диизопропилкарбодиимид, 1-гид-роксибензотриазол и тиоанизол (Мегск, Германия). Все остальные реагенты и растворители были отечественного производства и использовались после соответствующей очистки.
Взрослых самцов мышей линии BALB/c и крыс линии Wistar получали из питомника ФИБХ РАН.
Иммунорфин (SLTCLVKGFY), октарфин (TPLVTLFK) и его аналоги (LPLVTLFK, TLLVTLFK, TPLVLLFK, TPLVTLLK, TPLVTLFL) были синтезированы на автоматических синтезаторах (Applied Biosystems, модель 430A и Vega Coupler, модель C250, США) с использованием Boc/Bzl-тактики наращивания пептидной цепи и очищены препаративной обращеннофазовой хроматографией (хроматограф Gilson, Франция), колонка Waters SymmetryPrep C18 (19 х 300 мм) (Malva, Греция), как описано ранее [15]. В качестве постоянных защитных групп были использованы 2-хлорбензилоксикарбонильная и дихлорбензиль-ная для лизина и тирозина соответственно. По завершении сборки защищенной полипептидной цепи конечный продукт деблокировали с одновре-
менным отщеплением его от полимера с помощью безводного фтористого водорода в присутствии скавенджеров. Синтезированные пептиды охарактеризованы с помощью аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ (хроматограф Gilson, Франция), колонка XTerra RP18 (Malva, Греция), аминокислотного анализа (гидролиз 6 М HCl, 24 ч, 110°C; аминокислотный анализатор LKB 4151 Alpha Plus (Швеция) и масс-спектрометрического анализа (масс-спектрометр Finnigan, США).
[3Н]октарфин получали реакцией высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) [16]. К раствору 2.0 мг октарфина в 0.5 мл воды добавляли 50 мг окиси алюминия и упаривали на роторном испарителе. Окись алюминия с нанесенным пептидом смешивали с 10 мг катализатора (5% Rh/Al2O3). Полученную твердую смесь помещали в ампулу объемом 10 мл. Ампулу вакуумировали, заполняли газообразным тритием до давления 250 мм рт. ст., нагревали до 170°C и выдерживали при этой температуре в течение 20 мин. Затем ампулу охлаждали, вакуумировали, продували водородом и повторно вакуумировали. Меченый пептид экстрагировали из твердой реакционной смеси двумя порциями по 3 мл 50% водного этанола, полученный раствор объединяли и упаривали. Для удаления лабильного трития процедуру повторяли дважды. Очистку [3Н]октарфина проводили методом ВЭЖХ со спектрофотометром Beckman при длинах волн 254 и 280 нм, колонкой Kromasil (4 х 150 мм), зернение 5 мкм при 20°C, элюент — 0.1% три-фторуксусная кислота, градиент метанола 42— 70% за 20 мин, скорость потока 3 мл/мин. Включение трития в пептид рассчитывали с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика.
Мембранную фракцию коры головного мозга крысы получали согласно методу Налдини [17]. Животных забивали декапитацией, извлекали мозг и измельчали его скальпелем в чашке Петри с ледяным 10 мМ трис-НО-буфером, pH 7.4, содержащим PMSF (0.6 г/л). Измельченную ткань гомогенизировали в большом объеме этого же буфера с помощью гомогенизатора (Политрон, Россия). Гомогенат центрифугировали при 150000 g в течение 10 мин при 4°C. Осадок ресуспендирова-ли в большом объеме 10 мМ трис-НО-буфера, содержащего 0.15 М NaCl, pH 7.4, помещали в ледяную баню на 1 ч и снова центрифугировали при тех же условиях. Осадок ресуспендировали в буферном растворе, используемом для радиоли-гандного анализа. Концентрацию белка определяли по Лоури [18], используя в качестве стандарта раствор БСА.
Реакцию связывания [3Н]октарфина с фракцией синаптических мембран мозга крысы проводили по следующей схеме: суспензию мембран (5 мг белка) инкубировали с меченым пептидом (10-10—10-7 M, три параллельные пробы для каждой концентрации) в 1 мл 50 мМ трис-HCl,
pH 7.4, содержащего ингибитор сериновых про-теаз PMSF (0.6 г/л) и налоксон (1 мкМ), при 4°С в течение 40 мин. По окончании инкубации фракцию мембран переносили на стекловолокнистые фильтры GF/B (Whatman, Англия) и промывали 5 мл охлажденного 50 мМ трис-HCl, pH 7.4. Радиоактивность на фильтрах подсчитывали с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика LS 5801 (Beckman, США). Величину неспецифического связывания меченого пептида с мембранами определяли в присутствии 1000-кратного избыт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.