БИОХИМИЯ, 2003, том 68, вып. 1, с. 42 - 51
УДК 517.354
СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПЕПТИД VKGFY И ЕГО ЦИКЛИЧЕСКИЙ АНАЛОГ СТИМУЛИРУЮТ БАКТЕРИЦИДНУЮ АКТИВНОСТЬ МАКРОФАГОВ ЧЕРЕЗ НЕОПИОИДНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ
р-ЭНДОРФИНА*
© 2003 г. Е.В. Наволоцкая1**, А.А. Колобов2, Е.А. Кампе-Немм2, Т.А. Заргарова1, Н.В. Малкова1, С.Б. Краснова1, Ю.А. Ковалицкая1, В.П. Завьялов3, В.М. Липкин1
1 Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290Пущино Московской обл., пр. Науки, 6; факс: (0967)79-0527, электронная почта: navolots@fibkh.serpukhov.su 2ГНЦГосударственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов, 197110 Санкт-Петербург, ул. Пудожская, 7; факс: (812)235-5504
3Центр инженерной иммунологии «Биокад», 142380Любучаны Московской обл., Чеховский район; факс: (095) 797-5689
Поступила в редакцию 18.07.02
Синтезированы линейный и циклический пентапептиды, аминокислотная последовательность которых соответствует фрагменту 369—373 тяжелой цепи иммуноглобулина G человека — VKGFY (авторское название пептидов — пентарфин и циклопентарфин соответственно). Изучено влияние пентарфина и циклопентар-фина на фагоцитоз бактерий вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415 перитонеальными макрофагами мыши in vitro. Контрольные эксперименты показали, что макрофаги активно фагоцитируют бактерии этого штамма, но не переваривают их: поглощенные сальмонеллы не только сохраняли жизнеспособность, но и размножались внутри фагоцитов и через 12 ч весь монослой макрофагов разрушался (незавершенный фагоцитоз). Добавление в среду культивирования пентарфина или циклопентарфина в концентрации 1 нМ приводило к значительному увеличению бактерицидной активности макрофагов, в результате за 6 ч они переваривали все поглощенные микроорганизмы (завершенный фагоцитоз). Для изучения рецепции пентар-фина и циклопентарфина был получен 1251-меченый пентарфин с удельной активностью 179 Ки/ммоль. Связывание 1251-меченого пентарфина с перитонеальными макрофагами мыши характеризовалось насыщаемостью и высокой аффинностью (Kd 3,6 ± 0,3 нМ). Исследование специфичности связывания показало, что оно не чувствительно к налоксону и [Ме^энкефалину, но на 100% ингибируется немеченными цикло-пентарфином (K 2,6 ± 0,3 нМ), иммунорфином (3,2 ± 0,3 нМ) и ß-эндорфином (2,8 ± 0,2 нМ). Следовательно, действие пентарфина и циклопентарфина на макрофаги опосредовано через общие для пентарфина, циклопентарфина, иммунорфина и ß-эндорфина не чувствительные к налоксону рецепторы.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фагоцитоз, макрофаг, ß-эндорфин, тафтсин, налоксон, иммуноглобулин G, пептиды, рецепторы, иммунная система.
Открытие Найяром в 1970 г. эндогенного тетрапептида тафтсина (ТИг-1у8-Рго-Л^, фрагмент 289—292 СН2-домена Н-цепи иммуноглобулина О человека (]^О)), обладающего одновременно иммуностимулирующей и нейротроп-ной активностями [1—4], явилось стимулом для поиска новых биологически активных пептидов иммуноглобулинового происхождения. В 1980 г. Джулиард и др. обнаружили в составе Н-цепи ^О последовательности, подобные адренокор-тикотропному гормону и р-эндорфину [5]. Хоук и сотр. синтезировали тетрадекапептид 8ЕТ-
* Ускоренная публикация.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
СЕУКОРУР8В1, соответствующий р-эндорфи-ноподобной последовательности ^О (фрагмент 364—377 СН3-домена Н-цепи), и показали, что он конкурирует с 1251-меченым р-эндорфином за связывание с мембранами головного мозга крысы [6]. Нами был синтезирован декапептид 8ЬТ-СЕУКОРУ (авторское название пептида — им-мунорфин), соответствующий последовательности 364—373 Н-цепи ^О человека, и установлено, что он ингибирует связывание 1251-мече-ного р-эндорфина с перитонеальными макрофагами мыши (К 5,9 нМ) [7] и Т-лимфоцитами крови человека (К 0,6 нМ) [8, 9]. Изучение специфичности общих для Р-эндорфина и имму-норфина сайтов связывания показало, что они
не чувствительны к природным опиоидным пептидам — [Met5] - и [Ьеи5]энкефалину, а также к антагонисту опиоидных рецепторов — налоксону, т.е. являются неопиоидными. Одновременно мы показали, что p-эндорфин и иммунорфин стимулируют индуцированную конканавалином А (Con А) пролиферацию Т-лимфоцитов человека in vitro [10]. Протестированные параллельно [Ме^]энкефалин и налоксон были неактивны. Налоксон не ингибировал стимулирующий эффект p-эндорфина и иммунорфина на пролиферацию Т-лимфоцитов. На следующем этапе исследований мы получили 1251-меченый иммунорфин с удельной активностью 232 Ки/ммоль и показали, что он с высоким сродством связывается с Т-лимфоцитами человека (Kd 7,4 нМ) [7, 8]. Связывание меченого иммунорфина не зависело от присутствия налоксона и на 100% ингибировалось немеченным р-эндорфином (K 1,1 нМ) [11]. Эксперименты по ингибирова-нию связывания 1251-меченого p-эндорфина с Т-лимфоцитами синтетическими фрагментами иммунорфина показали, что самым коротким активным фрагментом иммунорфина является пентапептид иммунорфина(6—10) — VKGFY (авторское название пептида — пентарфин) [8].
Цель настоящей работы — исследование влияния пентарфина и циклопентарфина на фагоцитоз перитонеальными макрофагами мыши бактерий вирулентного штамма S. typhimurium 415 in vitro, а также получение 1251-меченого пентарфина и изучение его связывания с макрофагами.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали [Ме^]энкефалин, р-эн-дорфин, налоксон, тафтсин, 1,3,4,6-тетрахлор-3а,6а-дифенилгликоурил (иодоген), среды для культивирования клеток, фетальную сыворотку теленка («Sigma», США); L-глутамин и Hepes («ICN», США); пенициллин и стрептомицин («Gibco», США); агарозу, сахарозу, БСА, ЭДТА, ЭГТА, Tris, фенилметилсульфонилфторид (PMSF), азид натрия (NaN3) («Serva», Германия), сцин-тиллятор Unisolv 100 («Amersham», Англия). Третбутилоксикарбонильные производные аминокислот получены по ранее предложенным методикам [12]. N-Метилпирролидон, диизопро-пилкарбодиимид, 1-гидроксибензотриазол и тиоанизол приобретены у фирмы «Merck» (Германия). Все остальные реагенты и растворители были отечественного производства и использовались после соответствующей очистки.
Пептиды были синтезированы на автоматических синтезаторах («Applied Biosystems», модель 430А и «Vega Coupler», модель C250, США)
с использованием Boc/Bzl-тактики наращивания пептидной цепи. Синтез пентарфина проведен на фенациламидометил (РАМ)-полимере по ранее предложенной методике in situ [13]. В качестве постоянных защитных групп были использованы 2-хлорбензилоксикарбонильная и дихлорбензильная для лизина и тирозина соответственно. По завершении сборки защищенной полипептидной цепи конечный продукт деблокировали с одновременным отщеплением его от полимера с помощью безводного фтористого водорода в присутствии скавенджеров.
Защищенный циклопентарфин был получен на оксим-полимере [14]. Циклизацию проводили обработкой раствором уксусной кислоты в диметилформамиде в присутствии диизопропил-этиламина. Защищенный циклический пептид высаживали эфиром, фильтровали, высушивали до постоянной массы и обрабатывали безводным жидким фтористым водородом.
Оба пептида были очищены до гомогенного состояния препаративной обращеннофазовой хроматографией (хроматограф Gilson (Франция), колонка Waters SymmetryPrep C18 (19 х 300 мм) («Malva», Греция), 7 мкм, скорость потока 10 мл/мин, элюент — 0,1%-ная трифторуксусная кислота, градиент ацетонитрила 10—40% за 30 мин). Синтезированные соединения охарактеризованы данными аналитической обращеннофазовой ВЭЖХ (хроматограф Gilson (Франция), колонка XTerra RP18 («Malva», Греция), 125 Á (3,9 х 150 мм), 5 мкм, скорость потока 1 мл/мин, элюент — 0,1%-ная трифторуксусная кислота, градиент ацетонитрила 10—40 и 20—40% за 16 мин для пептарфина и циклопептарфина соответственно), аминокислотного анализа (гидролиз 6 М HCl, 24 ч, 110°; аминокислотный анализатор LKB 4151 Alpha Plus (Швеция)) и масс-спектрального анализа (масс-спектрометр Finnigan, США).
В экспериментах по фагоцитозу был использован вирулентный штамм Salmonella typhimurium 415 с типичными морфологическими и функциональными свойствами и LD50 ~100 микробных клеток при внутрибрюшинном заражении белых мышей. Сальмонелезную бактериальную культуру выращивали в течение 4—6 ч при 37° в бульоне Хоттингера, пересевали на мясопептон-ный агар и инкубировали при 37° в течение 18 ч.
Макрофаги брюшной полости мышей выделяли и культивировали согласно рекомендациям работы [15]. Фагоцитарную активность макрофагов изучали по разработанной нами методике [16]. Полученные с помощью соответствующих препаративных процедур монослои макрофагов на покровных стеклах культивировали при 37° в стерильных стеклянных пробирках со средой 199, содержащей стрептомицин и пенициллин (по
100 мкг на 1 мл среды каждого антибиотика) и инактивированную эмбриональную сыворотку теленка (5%). Спустя 1 сут. макрофаги заражали средой 199, содержащей сыворотку и бактериальную культуру S. typhimurium 415 в таком количестве, чтобы ее конечное разведение составляло 108 микробных клеток на 1 мл среды. Через 2 ч контакт между макрофагами и микробами прерывали, заменяя среду заражения средой культивирования, содержащей антибиотики. Для предотвращения захвата макрофагами микробов, высвобождающихся из разрушенных фагоцитов, в дальнейшем через каждый час среду культивирования заменяли свежей. Фиксирование макрофагов на покровных стеклах проводили через 1, 2, 4, 7 и 12 ч (метанол, 3 мин). Затем полученные препараты окрашивали 0,1%-ным водным раствором красителя азур II—эозин в течение 5 мин. Под микроскопом при увеличении х1350 на каждом стекле просматривали по 300 клеток, определяя следующие показатели: фагоцитарную активность (ФА) — процент макрофагов, участвующих в фагоцитозе; цитопатическое действие бактерий (ЦПД) — процент фагоцитов, разрушенных внутриклеточными бактериями; фагоцитарное число (ФЧ) — среднее количество микробов, приходящееся на один макрофаг.
Введение 125I в пентарфин (10 мкг) проводили с помощью Na[125I] (1 мКи) и иодогена [17]. Для выделения иодированного пептида реакционную смесь наносили на колонку (0,9 х 10 см) с сефадексом G-10. Элюирование проводили 50 мМ фосфатным бу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.