ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 48, № 3, с. 313-322
УДК 577.112,582.284.51
СИНТЕЗ АУКСИНА ВЫСШИМ ГРИБОМ Lentinus edodes (Berk.) Sing В ПРИСУТСТВИИ НИЗКИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ СОЕДИНЕНИЙ
ГРУППЫ ИНДОЛА
© 2012 г. О. М. Цивилева, Е. А. Лощинина, О. Е. Макаров, В. Е. Никитина
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, 410049
e-mail: tsivileva@ibppm.sgu.ru Поступила в редакцию 21.03.2011 г.
Исследовано образование ауксина в глубинной культуре ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler] (шиитаке). Выявлены биологически активные вещества индольной природы, "эффект малых доз" которых заключается не только в стимулировании роста мицелия (индолил-3-уксусная кислота, 2 х 10-7—2 х 10-4 г/л), но и в индуцировании триптофан-независимого пути биосинтеза ауксина. Указанный путь реализуется в присутствии экзогенного индола (1 х 10—3— 1 х 10-4 г/л), а также при индуцировании биосинтеза индолил-3-уксусной кислоты ее микродобавками (1 х 10-5— 1 х 10-8 г/л), и сопровождается образованием антраниловой кислоты (до 1.5 мг/л). Выявлена индукция генеративной стадии развития шиитаке индольным производным. Установлено, что среди изученных соединений только индолацетамид в концентрации порядка х10-4 г/л в культуральной жидкости L. edodes оказывает ярко выраженное стимулирующее влияние на формирование коричневой мицелиальной пленки шиитаке.
Свойства соединений фитогормональной природы, характеризующиеся высокой степенью изученности у высших растений и интенсивно исследуемые у почвенных ассоциативных микроорганизмов, лишь в несистематическом порядке и на явно недостаточном уровне описаны у макробази-диальных грибов. Ауксины являются наиболее изученной группой фитогормональных веществ. В качестве объекта исследований, наряду с другими микологическими объектами промышленного культивирования, особый интерес представляет высший гриб-ксилотроф, сочетающий высокую практическую значимость и явно недостаточно изученные физиолого-биохимические особенности, базидиомицет Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler] (шиитаке). Достаточно давно выдвигаются предположения о том, что фитогормоны, в том числе представители группы ауксинов, принимают участие в процессах роста и цитодифференцировки не только у растений, но и у грибов. Однако этот вопрос до сих пор остается практически неисследованным.
Особый интерес вызывают эффекты и механизмы действия биологически активных веществ в "малых дозах". В малых и сверхмалых концентрациях (10-20—10-13 моль/л) проявляют свою активность многие природные хемомедиаторы — токсины и противоядия, вещества, предупреждающие об опасности, феромоны, криопротекторы, другие соединения, в том числе фитогормоны [1]. Описан
парадоксальный характер действия низких концентраций токсичных веществ и лекарственных препаратов, который заключается, в частности, в бимодальной или полимодальной зависимости "доза—эффект". Отмечается [2], что последствия от воздействия малых доз ксенобиотиков могут быть не менее серьезными, чем последствия от высоких разовых доз: под их влиянием могут меняться существующие связи, давать сбой некоторые системы адаптации, поскольку организм способен приспосабливаться лишь к эффектам, лежащим в обычном диапазоне действия.
Известно два основных пути биосинтеза фито-гормона индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) — триптофан-зависимый (Трп-зависимый), при котором предшественником ИУК служит аминокислота триптофан, и триптофан-независимый (Трп-независимый), когда ИУК образуется из индола, антраниловой кислоты, индолил-3-глицерофос-фата [3]. Трп-зависимый синтез ИУК микроорганизмами может проходить по одному из 4 путей: через индолил-3-пировиноградную кислоту и ин-долил-3-уксусный альдегид (наиболее распространенный путь); через триптамин и индолил-3-ук-сусный альдегид; через индолил-3-ацетамид либо через индолил-3-уксусный нитрил. По некоторым данным, индолилацетальдоксим может также конвертироваться в ИУК через индолилацетальдегид [4, 5]. Многие фитопатогенные грибы и бактерии обладают несколькими путями биосинтеза ИУК.
Пути биосинтеза ИУК у макробазидиомицетов рассматривались, в лучшем случае, только на уровне положительного/отрицательного влияния добавок триптофана к среде выращивания.
Цель работы — исследование состава группы индольных метаболитов, сопровождающих продукцию ИУК базидиомицетом ЬвпИпш edodes, установление, является ли этот путь биосинтеза ИУК Трп-зависимым, либо происходит переключение на Трп-независимый путь при выращивании ксилотрофа в присутствии экзогенных синтетических аналогов соединений — предшественников ИУК.
МЕТОДИКА
В работе использовали культуру ЬепИпш edodes, штамм F-249, полученный из коллекции высших базидиальных грибов кафедры микологии и альгологии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Культуру гриба поддерживали на сусло-агаре при 4°С.
В качестве инокулята использовали 14-суточ-ную культуру Ь. edodes, выращенную на агаризо-ванном пивном сусле (4° по Баллингу). Температура выращивания — 26°С. Из полученного мицелия в стерильных условиях с помощью металлического пробойника диаметром 5 мм получали блоки, которыми инокулировали жидкие питательные среды из расчета 2 блока на 20 мл среды.
Глубинную культуру гриба выращивали на жидкой синтетической глюкозо-аспарагиновой среде (глюкоза — 9, Ь-аспарагин — 1.5 г/л), на пивном сусле (1.2° по Баллингу). Для определения сухой биомассы мицелий фильтровали через предварительно взвешенные на аналитических весах фильтры и высушивали до постоянной массы.
Для исследования влияния соединений ин-дольной природы их добавляли в виде растворов в смеси этанол — Н20 (1 : 1, по объему) к подвергнутой автоклавированию глюкозо-аспарагиновой среде непосредственно перед посевом в стерильных условиях. Концентрации индольных соединений в питательной среде 0.1; 1; 10 и 100 мг/л. Действие ИУК на рост культуры изучали в интервале 10-8—10-1 г/л.
Индольные соединения определяли в культу-ральной жидкости методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием в качестве стандартов чистых коммерческих препаратов ИУК, Трп, триптамина (ТАм), ин-долилацетамида (ИААм), индолилпировиноград-ной кислоты (ИПВК), индолилацетальдегида (ИААльд), индола, индолил-3-ацетонитрила, ан-траниловой кислоты и 5-гидрокси-индолил-3-ук-
сусной кислоты (5-гидрокси-ИУК). Для идентификации и количественного определения индольных соединений пробы культуральной жидкости отбирали в стерильных условиях в процессе роста культуры, фильтровали, используя фильтры фирмы "Millipore" (Ирландия) типа 0.22 мкм GVPP (торговой марки "Durapore® membrane filters"), и анализировали. Распределительную обращено-фазовую ВЭЖХ проводили на носителе с химически связанными гидрофобными остатками С18 (5 мкм). Колонка (150 х 4.6 мм) "Luna 5ц С18(2)" ("Phenomenex", США), снабженная предколон-кой (типа Security Guard) той же марки. Элюент — смесь метанол—вода (36 : 64 либо 50 : 50, об./об.). Использовали детектор УФ-поглощения, работающий в диапазоне длин волн 250—300 нм. Объем пробы 20 мкл, давление 12 МПа.
Использовано массовое (m/V) выражение концентрации индольных соединений в жидких средах. Выбранный способ выражения концентрации используется в абсолютном большинстве опубликованных статей, имеющих отношение к представленной в настоящей работе тематике, и поэтому позволяет проводить сравнения в наиболее удобной для восприятия форме.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Промежуточные продукты биосинтеза ИУК у L. edodes. Нашим предположениям о существовании Трп-зависимого синтеза ИУК грибом способствовали следующие наблюдения.
1. Обнаружено явление биосинтеза внеклеточного Трп изученным штаммом L. edodes. На синтетической среде, изначально не содержащей этой аминокислоты, концентрации Трп изменялись в пределах от 14 на 7 сут до 24 мг/л на 21 сут. При этом снижение концентрации наблюдалось на 7 и 14 сут. Для всех изученных возрастов культуры внесение в среду добавок Трп (10 и 100 мг/л) привело к значительному повышению содержания этого вещества в культуральной жидкости по сравнению с исходным. Максимальное количество Трп, составившее около 330 мг/л, отмечено на 14 сут на среде с добавкой 100 мг/л этой аминокислоты.
2. Выявлено, что глубинная культура L. edodes F-249, растущая на глюкозо-аспарагиновой среде, способна к образованию экстрацеллюлярной ИУК. В контрольном опыте наибольшая концентрация этого ауксина (около 7.5 мг/л) наблюдалась на 21сут. При экзогенном введении в питательную среду Трп содержание ИУК повысилось, а максимума (9.4 мг/л) достигло на 14 сут на среде с добавкой 100 мг/л аминокислоты, т.е. при наибольшей концентрации Трп.
СИНТЕЗ АУКСИНА ВЫСШИМ ГРИБОМ Ьепйпш еёоёея Влияние индола на образование внеклеточных индольных соединений грибом Ь. edode5 F-249
Условия опыта
Конечная концентрация в культуральной жидкости, мг/л
Добавка Время культивиро- ТАм ИААм ИУК ИПВК Трп
индола, мг/л вания, сут
Контроль (среда 3 3.7 ± 3.3 3.7 н.о.* 19.5±
без индола) 7 3.8 3.2 н.о. н.о. 13.8
10 4.2 3.1 н.о. н.о. 18.6
14 3.4 2.3 3.7 0.9 16.9
21 3.9 3.7 7.4 7.7 23.9
0.1 3 3.1 3.4 4.0 1.0 17.5
7 1.3 н.о. н.о. 0.3 9.5
10 1.9 н.о. н.о. 0.7 10.8
14 2.5 2.6 6.9 5.3 16.1
21 3.3 3.4 9.0 11.6 20.5
1 3 2.5 2.7 5.5 н.о. 14.8
7 1.3 н.о. н.о. 0.4 8.3
10 1.5 н.о. н.о. 0.9 9.8
14 2.3 2.3 5.6 2.8 16.2
21 2.9 2.7 7.4 5.9 16.7
10 3 2.9 3.0 3.4 0.5 17.1
7 1.9 н.о. н.о. 0.3 9.9
10 1.8 н.о. н.о. 0.9 7.9
14 2.4 2.2 6.2 4.7 15.6
21 3.7 2.7 8.1 7.7 17.2
100 3 3.1 3.5 н.о. 0.2 13.9
7 1.2 н.о. н.о. 0.4 13.9
10 1.2 н.о. н.о. 0.4 10.1
14 2.4 2.2 6.1 4.2 15.5
21 3.3 2.2 2.2 16.7 19.1
* н.о. — не определяется.
Таким образом, на стартовых позициях выявления способа образования фитогормона культурой гриба налицо была биосинтетическая способность гриба в отношении ИУК и ее предшественника Трп.
Основные известные пути биосинтеза ИУК связаны с Трп. Путь, не зависимый от триптофана (Трп-независимый), встречается у растений, а среди бактерий обнаружен у азос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.