Ростовые характеристики фототрофной культуры R. capsulatus B10 при культивировании в режиме хемостата с лимитированием светом*
Скорость протока, ч-1 Биомасса Бактериохлорофилл a
г/л г/л ч 1 мкг/мл мг/г сухой биомассы мг/л ч 1
0.04 3.5 0.14 37.8 10.9 1.5
0.06 3.5 0.21 53.3 15.1 3.2
0.08 3.0 0.24 37.6 12.6 3.0
0.11 2.8 0.31 36.1 12.8 3.9
* Представлены результаты по накоплению биомассы (г/л), производительности по биомассе (г/л ч х), а также по накоплению Бхл a (мкг/мл и мг/г сухой биомассы) и производительности по Бхл a (мг/л ч-1).
трофных условиях при р02 = 2% было выше, чем в клетках, выросших в фотогетеротрофных условиях [11]. В доступной нам литературе данные об оптимизации синтеза Бхл а отсутствуют.
Цель работы - подбор условий для максимальной скорости синтеза Бхл непрерывной темновой аэробной культурой R. capsulatus и сравнение ее с культурой в фотогетеротрофных условиях.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служила пурпурная несерная бактерия R. capsulatus B10, полученная из коллекции кафедры микробиологии МГУ. Культуру выращивали на среде YPS, содержащей (г/л): MgSO4 - 0.52, CaCl2 - 0.22, дрожжевой экстракт - 3, пептон - 3, а также на среде Ормерода с тиамином в концентрации 1 мг/л [12]. В качестве источника углерода вносили ацетат или лактат (80 мМ для каждого, если не указано отдельно). Посевную культуру выращивали анаэробно на свету или аэробно в темноте при 30°С на ацетате или лак-тате (40 мМ для каждого), в зависимости от используемого субстрата в реакторе. Непрерывное культивирование проводили на свету в анаэробных условиях в фотобиореакторе (ФБР), описанном ранее [13], но с увеличенным объемом (7.6 л), в режиме хемостата с лимитированием светом, а в темноте в аэробных условиях в биореакторе (установка "АНКУМ", Пущино) с рабочим объемом 1 л, с контролируемой подачей воздуха в режимах рН-ауксо-стата и хемостата с лимитированием кислородом (в зависимости от постановки эксперимента). Для создания аэробных условий в биореактор подавали воздух со скоростью, которая регулировалась автоматически для поддержания заданного рО2 (в режиме рН-ауксостата). В режиме хемостат с лимитированием кислорода скорость расхода воздуха была постоянной, как указано в подписях к рисункам. Культивирование в биореакторах проводили при 30°С с контролем рН (7.0, если не указано отдельно), Eh и рО2 с помощью программно-управляемого
комплекса. рН в биореакторе в режиме хемостата поддерживали подачей 0.5 М раствора NaOH.
По достижению культурой равновесного стационарного состояния (4-5 генераций), которое определяли по величине оптической плотности (D650), производили отбор проб на сухую биомассу [13] и содержание Бхл a [14]. Производительность по биомассе или Бхл a определяли как произведение скорости протока (ч-1) на концентрацию биомассы (г/л) или Бхл (мг/л).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Синтез бактериохлорофилла а в фотогетеротрофных условиях. Ранее было показано, что в ФБР на основе коаксиальных цилиндров с перемешиванием объемом 1 л максимальная производительность при выращивании R. capsulatus достигала 0.36 г/л ч-1при интенсивности света 180 Вт/м2 [13]. Нами был изготовлен ФБР большего объема (7.6 л), в котором, по сравнению с описанным, была увеличена высота. Кроме того, для удешевления процесса культивирования, культуры не продували аргоном, а заполняли реактор полностью, достигая тем самым анаэробных условий. Обнаружено (таблица), что при освещении культур лампами накаливания интенсивностью 100 Вт/м2 при скорости протока 0.11 ч-1 производительность ФБР по биомассе при выращивании R. capsulatus составляла 0.31 г/л ч-1. Таким образом, более чем семикратное масштабирование культивирования практически не снижало производительности реактора. Для того, чтобы культура была лимитирована именно светом, а не источником углерода или азота, в среду вносили 80 мМ молочной кислоты и 20 мМ (вдвое больше, чем в стандартной среде Ормерода) сульфата аммония. При культивировании в ФБР в режиме хемостата при лимитировании светом содержание Бхл в 1 г биомассы достигало 15 мг при скорости протока 0.06 ч-1. Увеличение скорости протока до D = 0.11 ч-1 приводило к снижению как концентрации сухой биомассы (до 3.0 г/л), так и Бхл a (до 12.0 мг/г сухой биомассы). Максимальная
Ц ч-0.16
0.12
0.08
0.04
0 0.4
0.3
0.2
0.1
0
С Бхл, мг/г С, г/л 1.2
С, г/л 0.8
40 60 РО2, %
1.0
0.8 0.6 0.4 0.2 0
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
С Бхл, мг/л 5
0 1.4 1.2 1.0
0.8 0.6 0.4 0.2
0
0.05
0.15
0.20
14 12 10 8 6 4 2 0
Рис. 1. Влияние р02 на удельную скорость роста Ц (ч-1, 1), равновесную концентрацию биомассы (С, г/л, 2), и Бхл а в биомассе (С Бхл, мг/г, 3) при росте R. capsulatus с использованием ацетата (а) или лакта-та (б).
производительность установки по Бхл а составила 3.90 мг/л ч-1.
Влияние р02 на рост биомассы в темновых аэробных условиях и синтез Бхл а Максимальная концентрация биомассы R. capsulatus при выращивании в фотогетеротрофных условиях была ниже 4.0 г/л (таблица). В то же время обычное промышленное культивирование в реакторах в аэробных условиях проводится при концентрации не ниже 20 г/л [15]. Кроме того, для промышленного культивирования пурпурных бактерий стерилизуемые ФБР закрытого типа с объемом больше 1000 л еще не разработаны. Поэтому тем-новое аэробное культивирование пурпурных бактерий для получения Бхл а представляется в настоящее время более перспективным.
При изучении влияния концентрации кислорода на рост R. capsulatus в темновых аэробных условиях и синтез ею Бхл а, использовали в качестве органического субстрата не только лактат, но и ацетат, который дешевле лактата более, чем в 2 раза. Исследовали влияние р02 как в широких пределах (от низких значений до 85% насыщения воздухом на ацетате и до 40% на лактате), так и в области лимитирования кислородом.
0.10
D, ч1
Рис. 2. Влияние скорости протока (ч-1) на равновесную концентрацию биомассы (г/л, 1) и содержание Бхл а в сухой биомассе (мг/л, 2) при росте R. capsulatus с использованием ацетата (а) или лактата (б) в режиме хемостата с лимитированием кислородом.
В экспериментах первого рода применяли режим рН-ауксостата, позволяющий поддерживать культуры при максимальной скорости роста. Как при использовании ацетата (рис. 1а), так и лактата (рис. 16) с увеличением р02 содержание Бхл а в биомассе снижалось, в соответствии с описанными во введении данными. Повышение р02 приводило также к снижению равновесной концентрации биомассы как при использовании ацетата, так и лактата. Это косвенно свидетельствует о возрастании энергии поддержания жизнедеятельности, хотя для окончательного вывода необходимо провести полный анализ материально-энергетического баланса. Следует отметить, что если в присутствии ацетата скорость роста культур в хемотрофных условиях была близка к таковой в фотогетеротрофных условиях, то в присутствии лактата она была значительно выше: 0.37-0.40 ч-1 (рис. 16) и 0.23 ч-1 (взято из [3]) соответственно.
Эксперименты по культивированию R. capsulatus при очень низких значениях р02 проводили в режиме хемостата. Лимитирование кислородом достигали подачей воздуха с низкой скоростью (12 мл/мин) и поддержанием постоянной скорости перемешивания. При этом содержание кислорода в газовой фазе на выходе из биоректора не превышало 5% (измеря-
С, г/л 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
С Бхл,
мг/г 16
...........
0 6.0
1
1в — ■
2
V
_|_I_I_I_1_
14 12 10 8 6 4 2
6.5 7.0 7.5 8.5 8.0 рН
0 9.0
Рис. 3. Влияние рН культивирования на равновесную концентрацию биомассы (г/л, 1) и содержание в ней Бхл а (мг/г, 2) при выращивании R. capsulatus на среде с лактатом в хемостате с лимитированием р02.
ли с помощью ГХ). Значение р02 в суспензии клеток, согласно показаниям датчика, составляло 00.4%. Оба вышеуказанных обстоятельства свидетельствовали о наличии лимитирования кислородом. Точность измерений р02 в этом диапазоне недостаточна для того, чтобы определить вид зависимости скорости роста от концентрации растворенного кислорода. Однако из общих свойств хемостата следует, что при лимитировании каким-либо субстратом удельная скорость роста ц снижается при уменьшении его концентрации в культуральной жидкости. Следовательно, в данном эксперименте снижение скорости протока (то есть скорости роста ц) означало уменьшение р02, то есть увеличение степени лимитирования культуры кислородом.
На среде с ацетатом максимальный синтез Бхл а (около 4.0 мг/л) достигался при скоростях протока 0.04-0.08 ч-1, а максимальная концентрация биомассы - 0.70 г/л при скорости протока 0.04 ч-1 (рис. 2а). Однако производительность по Бхл а на этом субстрате составила 0.34 мг/л ч-1 при скорости протока 0.08 ч-1 и была в 2 раза выше, чем при скорости протока 0.04 ч-1 (0.16 мг/л ч-1). Производительность по биомассе при В = 0.08 ч-1 была также выше (0.04 г/л ч-1), чем при В = 0.04 ч1 (0.03 г/л ч-1). На среде с лактатом максимальное содержание Бхл (16.0 мг/л) и биомассы (1.38 г/л) было достигнуто при скорости протока 0.07 ч-1 (рис. 26). Несмотря на то, что при В = 0.07 ч-1 на лактате концентрация Бхл была максимальной, производительность по Бхл при этой скорости протока была несколько ниже (1.14 мг/л ч-1), чем при В = 0.10 ч-1 (1.43 мг/л ч-1). Именно при В = 0.10 ч-1 достигалась максимальная производительность, не только Бхл а, но и биомассы, которая составила 0.12 г/л ч-1 против 0.09 г/л ч-1 при В = 0.07 ч-1.
С, г/л 3.5
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 20 15 10 5 0
С Бхл а,мг/г С Бхл, мг/г
(б) □ -
- \....... 2
- V / / 1 V -
3 €/ -
/ □' I 1 1 |
0
200
400 600 мл/мин
10
8
6
4
2
0 12
10
8
6
4
2
0
800 1000
20
15
10
5
0 160 140 120 100 80 60 40 20 0
Рис. 4. Концентрация сухой биомассы (г/л, 1), Бхл а в биомассе (мг/г, 2) и концентрация Бхл а в суспензии (мг/л, 3) в зависимости от скорости подачи воздуха (мл/мин) культурам, росшим в режиме хемостата с лимитированием кислородом в присутствии ацетата (а, В = 0.08 ч-1) или лактата (б, В = 0.1 ч-1).
При культивировании на обоих субстратах концентрации Бхл и биомассы снижались в областях как низких, так и высоких значений скор
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.