УДК 547.466.96:602.017.1-018+616-097
СИНТЕЗ ЭТИЛАМИДА ЦИКЛИЧЕСКОГО УНДЕКАПЕПТИДА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 593 - 603 ТРАНСМЕМБРАННОГО ГЛИКОПРОТЕИНА ёр-41 ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ВТОРОГО ТИПА
© 1995 г. М. В. Сидорова*, Е. В. Кудрявцева, А. С. Молокоедов, М. В. Овчинников, Ж. Д. Беспалова
Кардиологический научный центр Российской академии медицинских наук, 121552, Москва, 3-я Черепковская, 15-а Поступила а редакцию 18.11.94 г. После доработки 20.01.95 г.
Классическими методами пептидной химии в растворе осуществлен синтез этиламида циклического дисульфида пептидного антигена ВИЧ-2, соответствующего последовательности 593 - 603 белка gp-41. Показано отсутствие рацемизации при фрагментарной конденсации. Проведено сравнение различных методов образования дисульфидной связи.
Ключевые слова', антигенная детерминанта ВИЧ-2, фрагментная конденсация, рацемизация, дисульфидная связь, побочные реакции.
В настоящее время пептиды находят широкое применение в диагностике таких вирусных заболеваний, как СПИД [1, 2], Т-клеточный лейкоз (лимфома) [3], гепатит [4]
Преимущества пептидных диагностикумов общеизвестны - это высокая специфичность, возможность работы с индивидуальными, достаточно устойчивыми и легко стандартизируемыми антигенами.
Данная работа посвящена оптимизации синтеза ундекапептида, соответствующего последовательности 593 - 603 трансмембранного гликопро-теина gp-41 вируса иммунодефицита человека 2-го типа (ВИЧ-2):
Н-А8п-5ег-Тгр-С1у- Су5-А1а-РЬе-Аг§ С1п-Уа1-Су8 -ЫНЕ1
Этот пептид является фрагментом иммунодоми-нантной области указанного белка и, как показано в работе [5], обладает высокой специфичностью к сыворотке крови пациентов, инфицирован-
Использованы сокращения, рекомендованные комиссией IUPAC-IUB (Eur. J. Biochem. 1984. V. 183. P. 9 - 37), а также: Acm - ацетамидометил, Вое - mpem-бутилоксикарбонил, Bu' - трет-бутип, DMF - КЫ-диметилформамид, DCC -М,Ы'-дициклогексилкарбодиимид, ESI-MS - electro-spray ionisation mass spectrometry, HOBT - 1-гидроксибензотриазол, HONB - Г^-гидроксибицикло[2,2.1 ]гепт-5-ен-2,3-дикарбок-симид, DCHA - дициклогексиламин, HONp - 4-нитрофенол, HONSu - N-гидроксисукцинимид, TFA - трифторуксусная кислота, Z- бензштоксикарбонил, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита.
* Автор для переписки.
ных ВИЧ-2, и совершенно нечувствителен к сыворотке крови пациентов, инфицированных ВИЧ-1. Разработка оптимальной схемы синтеза данного пептида имеет принципиальное значение, так как на сегодняшний день это единственный антиген, входящий в состав диагностического набора "Пептоскрин", который отвечает за выявление антител к ВИЧ-2.
С-Концевая карбоксильная группа выбранного пептида была модифицирована этиламином. Введение этиламидной группировки, выполняющей в ходе синтеза роль защиты С-концевой карбоксильной функции, позволяет существенно упростить выделение промежуточных продуктов. Кроме того, такая модификация увеличивает ли-пофильность пептида и, по-видимому, должна улучшить его сорбцию на полистирольных планшетах, что особенно важно при использовании пептида в системе твердофазного иммунофер-ментного анализа.
Для синтеза вышеназванного пептида был выбран метод фрагментной конденсации в растворе, который в случае относительно коротких пептидов обеспечивает быстрое получение достаточно больших количеств целевого вещества. Синтезируемая последовательность была разбита на три фрагмента (рис. 1). Выбор фрагмента с С-концевым остатком глицина традиционен. При выборе второго фрагмента мы руководствовались данными [6] о возможности успешной, с высоким выходом и отсутствием рацемизации, конденсации
675
2*
Asn
Ser
Trp
Gly
Cys Ala Phe
Z-Z-
Boc —)- ONp H ■ Boc-
Boc-
Bu'
ONB H-
Bu'
Bu'
.Bu'
.Bu'
-ONSuH-
(VI)
(Vli)
(VIII)
-ONa
-OH Boc-• ONa Boc -■OH Boc-
0 Y TFA-H
■OH H-
| (2)
Acm
-ONp H-Acm
Acm
Acm
z.
Acm
z.
Acm
Z-
Arg
GIn
Val
Z-
■ ONp H-
Z--ONp H— OH
(III)
(IV)
(IVa)
(V)
(IX)
(IXa)
(IXa)
-OH -OH
■ OH Boc-• OH Boc-OH H-
Jü)
Boc-
Boc-
■ ONp H-
Botí
Boc - ONSu H
Cys
Acm
—(Z ONp
Acm
---NHEt
Acm
JZ,
(I)
(II)
(Па)
■ Nlüit
Acm
IZ
NHEt
Acm
z
NHEt
Acm
-NHEt Acm
Z-NHEt
Acm
z
NHEt
Acm
_z
NHEt
Acm
z
NHEt
Acm
z
NHEt
Acm
(Xa)
Acm
z
NHEt
NHEt
(X)
(XIII)
Рис. 1. Схема синтеза ундекапептида. (1) - HBr • Ру, DCC/IIOBT; (2) - DCC/HOBT; +N(CH3)3CH2C6H5.
фрагментов с С-концевым №-незащищенным аргинином. Такой вариант фрагментации привлекателен еще и тем, что при получении фрагментов с С-концевым незамещенным аргинином исключаются трудоемкие и плохо воспроизводимые стадии введения и удаления защит на гуани-диновую и карбоксильную функции этой аминокислоты.
Для временного блокирования а-аминогрупп использовались бензилоксикарбонильная и mpem-бутилоксикарбонильная защиты, которые в дальнейшем удалялись каталитическим гидроге-нолизом и ацидолизом соответственно. Сульф-гидрильная функция цисгеина блокировалась ацет-амидометильной группой, а гидроксильная функция серина - mpmz-бутильной защитой.
При синтезе пептидных фрагментов (V) и (VIII) карбоксильные группы остатков аргинина и глицина защищали солеобразованием. Это ограничило выбор метода образования пептидной связи и свело его к применению активированных эфи-ров, позволяющих работать с минимумом защитных групп. Этот метод образования пептидов ис-
пользовался и при получении фрагмента (И). Нами применялись ГЧ-гидроксисукцинимидные, п-нитро-фениловые эфиры и хорошо кристаллизующийся К-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидный эфир для присоединения остатка серина.
При синтезе фрагмента (V), как уже упоминалось, исходили из незамещенного аргинина. Присоединение и-нитрофениловых эфиров Z-aминo-кислот проводили в безводном 1>МР. Для очистки промежуточных К-защищенных пептидов был использован оригинальный метод хроматографии на силикагеле [7], позволяющий быстро и эффективно выделять из реакционной смеси достаточно большие количества аргининсодержа-щих пептидов. В качестве элюента использовалась смесь спирта и хлороформа. Характерной особенностью данного способа являются необычно высокая емкость силикагеля по отношению к аргининсодержащим пептидам (на колонке с 1 г сорбента можно разделить приблизительно 1 г смеси продуктов реакции) и возможность выделения продукта без размыкания внутримолекулярной соли между гуанидиновой и карбоксильной
(а) (б) (в)
0.5
-Л-
_1_
UU
о
20
40
0
20
40
0
20
40 мин
Рис. 2. ВЭЖХ на колонке Ш.гаярЬеге ОБ8 (4.6 х 250 мм) в градиенте концентрации ацетон итрила (7 —- 42% за 50 мин) в 0.05 М КН2ГО4 (рН 3) диастереомерных гептапептидов. гептапептид (XII), содержащий ¿»-аргинин (а); гептапептид (IX), содержащий ¿-аргинин (б); смесь диастереомеров (в). Скорость элюции 1 мл/мин.
группами аргинина. При этом выходы целевых соединений были высокими (82 - 91%).
В ходе синтеза фрагмента (VIII) при получении ди- (VI) и трипептида (VII) исходили из натриевых солей соответствующих аминокомпонентов, а реакцию конденсации проводили в водно-органической среде. При получении тетрапептида (VIII) исходили из растворимой в DMF бензилтриметил-аммониевой соли аминокомпонента, а реакцию конденсации проводили в безводной среде с целью предотвращения возможности омыления гс-нитрофенилового эфира и гидролиза амидной функции аспарагина в водно-щелочных условиях.
Для конденсации синтезированных блоков применялся карбодиимидный метод с добавками НОВТ или пентафторфенола, хорошо зарекомендовавший себя как в классическом, так и в твердофазном варианте синтеза для соединения фрагментов [8, 9]. Конденсацию аргининсодержащего тетрапептида (V) с соответствующим аминоком-понентом (Па) проводили DCC/HOBT-методом в DMF в присутствии 1 экв. бромгидрата пиридина, необходимого для размыкания внутримолекулярной соли в карбоксильном компоненте и прото-нирования его гуанидиновой группы [6]. При этом выход продукта конденсации (IX) составил 90%. Для оценки рацемизации остатка аргинина при проведении фрагментарной конденсации нами был получен аналог соединения (1Ха), содер-
жащий D-аргинин (соединение (XII), см. "Экспериментальную часть"). С помощью ВЭЖХ на обращенной фазе было показано, что целевой гептапептид L-конфигурации практически не содержит примеси диастереомера (рис. 2). Таким образом, полученные нами результаты хорошо согласуются с литературными данными [6] об отсутствии рацемизации при конденсации фрагментов с С-концевым незамещенным аргинином указанным выше способом.
Конденсация соединений (VIII) и (1Ха) проводилась также карбодиимидным методом в присутствии HOBT, Однако выход продукта был ниже, чем в первом случае (55 - 65%). По данным ВЭЖХ, пептид (X) содержал примесь аминокомпонента (гептапептида) в количестве 5 - 10%. Применение другого конденсирующего агента - комплекса F, увеличение избытка карбоксильного компонента до 1.3 - 1.5 экв., добавление в реакционную смесь N-метилпирролидона, увеличивающего растворимость исходных компонентов и продукта, не привели к существенному повышению выхода.
Защитные группы конечного ундекапептида (Ха) отщепляли действием TFA. Для очистки полученного соединения были параллельно использованы ВЭЖХ на обращенной фазе и ионообменная хроматография на сульфопропил-сефадексе (SP-сефадекс) в градиенте концентрации пиридин-ацетатного буфера от 0.05 до 1 М. Следует
Ag(CF3C0O)/H2O2; а - 12/АсОН; г- 12/МеОН. д - ВЭЖХ конечного продукта. Колонка Ultrasphere ODS (4 6 X 250 мм), элюция градиентом концентрации ацетонитрила (14 —^ 56% за 40 мин) в 0.05 М КН2Р04 (pH 3) со скоростью потока 1 мл/мин.
отметить, что оба метода очистки давали сравнимые результаты и обеспечивали получение вещества заданной чистоты.
Заключительным этапом работы была оптимизация условий деблокирования сульфгидрильных групп цистеина и замыкания дисульфидной связи. Несмотря на многообразие способов отщепления Б-Аст-защит и циклизации, в каждом конкретном случае выбор соответствующих реагентов представляет собой отдельную задачу. Следует также отметить, что выходы циклических дисульфидов часто невели
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.