БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 1, с. 125-128
^ ПИСЬМА
РЕДАКТОРУ
УДК 577.07:577.352.2:535.372:616-006
СИНТЕЗ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛОГА ЛИПОФИЛЬНОГО ПРОЛЕКАРСТВА МЕТОТРЕКСАТА
© 2014 г. Ю. В. Власенко, А. С. Алексеева, Е. Л. Водовозова#
ФГБУНИнститут биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
Поступила в редакцию 27.08.2013 г. Принята к печати 03.09.2013 г.
Синтезирован флуоресцентный зонд — аналог липофильного пролекарства противоопухолевого препарата метотрексата. Конъюгат несет остаток гас-1-[13-(Ме4-ВОВ1РУ-8)тридеканоил]-2-олео-илглицерина, соединенного сложноэфирной связью с метотрексатом через Ж-(метиленкарбонил)-Р-аланиновую вставку (Ме4-ВОБ1РУ-8 — 4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-3а,4а-диаза-5-ин-дацен-8-ил). Зонд предназначен для встраивания в мембрану липосом-носителей с целью изучения механизма взаимодействия с опухолевыми клетками и внутриклеточного транспорта.
Ключевые слова: метотрексат, липофильные пролекарства, липосомы, BODIPY-метка. DOI: 10.7868/S0132342314010126
Цитостатический препарат метотрексат (МТХ, антиметаболит фолиевой кислоты, схема) широко применяется в клинике для лечения солидных опухолей, гематологических злокачественных заболеваний и аутоиммунных патологий, таких как ревматоидный артрит, оставаясь до сегодняшнего дня "лекарством номер один" (обзоры [1—3]). МТХ конкурентно ингибирует дигидрофолатредуктазу (DHFR, КФ 1.5.1.3) и тем самым лишает клетку тетрагидрофолата, необходимого кофактора биосинтеза пуриновых нуклеотидов и тимидилата. Эффективность лечения МТХ ограничивается системной токсичностью и частым развитием лекарственной устойчивости, связанной, главным образом, с мутациями, приводящими к понижениию активности белка-транспортера восстановленного фолата (reduced folate carrier, RFC), переносящего также и аналоги-антифолаты [3] (пассивный трансмембранный перенос полярной молекулы МТХ затруднен). Для улучшения фармакологических свойств МТХ в последние годы возобновились активные исследования различных наноразмерных систем его доставки [1, 4], в том числе полиамидных дендримеров (см. например, [5]), полимерных конъюгатов [6] и липосом
Сокращения: МТХ — метотрексат; МТХ-DG — конъюгат МТХ с гас-1,2-диолеоилглицерином; DHFR — дигидрофо-латредуктаза; RFC — белок, транспортирующий восстановленный фолат; Me4-BODIPY-8 или BDP — 4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-3а,4а-диаза-5-индацен-8-ил; Gro — глицерин; Ole — олеоил (92-гептадеценил-17-карбонил); ТЕА — триэтиламин. # Автор для переписки (тел.: 8 (495) 330-66-10; факс: 8 (495) 330-66-01; эл. почта: elvod@lipids.ibch.ru).
[7, 8]. Конъюгаты с сывороточным альбумином и липосомы признаны наиболее перспективными для системного введения МТХ в организм [1].
Включение в липосомы и другие наноносители диаметра ~ 100 нм позволяет защитить лекарство от преждевременного разложения и нецелевых взаимодействий с биомолекулами, обеспечивает его накопление в опухолях и очагах воспаления (ввиду повышенной проницаемости дефектных стенок капиллярных сосудов и нарушенного дренажа лимфы в очагах патологии — так называемый эффект повышенной проницаемости и удерживания [9]), а также способствует преодолению развития множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток, связанной с флипазной функцией трансмембранных белков семейства АТР-связывающих кассет (например, Р-гликопротеина [10]). Для обеспечения эффективной концентрации лекарства в целевой ткани носитель должен обладать достаточно высокой емкостью загрузки. Однако внутренний объем наноразмерных липо-сом не позволяет стабильно инкапсулировать более 2—3 мол. % (от суммарных липидов) водорастворимого лекарства даже при практически максимальной достижимой концентрации его в растворе (см., например, [7]).
Нами ранее разработана липосомальная форма МТХ, в которой он включен в липидный би-слой в виде биодеградируемого производного — липофильного пролекарства — конъюгата с гас-1,2-диолеоилглицерином (МТХ-DG) [11, 12].
126
ВЛАСЕНКО и др.
Объемистый остаток МТХ отделен от диглице-ридного мембранного якоря короткой вставкой — ^-метиленкарбонил^-аланиновым остатком, который в бислое находится на уровне полярных головок фосфолипидов, что позволяет меньше нарушать упаковку бислоя и включать в 100-нм-липосомы не менее 10 мол. % пролекарства [13]. Остаток МТХ соединен со вставкой сложноэфир-ной связью, которая должна легко гидролизо-ваться в клетке-мишени ввиду низкой специфичности эстераз [14].
Ранее липофильная модификация глутаматных карбоксилов МТХ, позволяющая сохранить сродство к DHFR, была предложена для преодоления резистентности клеток, обусловленной нарушением активного транспорта: алифатические сложные у-эфиры [15] и амиды липоаминокислот [16] MTX, образующие в водных средах мицеллярные формы, были активны в культуре клеток острой Т-лимфобластоидной лейкемии CEM/MTX, резистентных к МТХ из-за дефицита RFC. В наших экспериментах МТХ-DG в липосомальной форме проявил цитотоксическую активность в культурах клеток меланомы М3 [12], а также лейкемии CEM-CCRF и ее резистентной сублинии CEM/MTX [13, 17]. Очевидно, конъюгат высвобождает МТХ за счет гидролиза внутриклеточными эстеразами, будучи пролекарством, либо он способен непосредственно ингибировать DHFR (благодаря свободному а-карбоксилу). Таким образом, липосомальная форма МТХ-DG представляет интерес для наномедицины. В то же время, механизм проникновения в опухолевые клетки пролекарства МТХ (например, возможное участие фолатного рецептора) и его внутриклеточный транспорт еще не исследованы. Для изучения этих процессов полезным инструментом представляется флуоресцентный зонд — аналог МТХ-DG. Кроме того, недавно нами получены важные сведения о гемосов-местимости липосомальной формы МТХ-DG: липосомы не оказывают отрицательного влияния на основные форменные элементы крови, однако в определенных условиях активируют систему комплемента [18]. Механизм активации также предполагается исследовать флуоресцентными методами — с применением этого зонда.
Цель данной работы — синтез аналога (VII) диглицеридного производного МТХ (схема), несущего высокочувствительную BODIPY-метку
(Ме4-БОВ1РУ-8 - 4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраме-тил-4-бора-3а,4а-диаза-5-индацен-8-ил) [19]. Полярность (Ме4-БОЭ1РУ-8)-группы (на схеме: БЭР-группа) относительно невысока, поэтому, при закреплении ее в ю-положении алифатической цепи остатка диглицерида она находится в бислое липосом, в основном, в гидрофобной области, не вызывая значительных возмущений в его структуре. Выбор БОЭ1РУ-метки обусловлен не только высоким квантовым выходом этого флуорофора, но и отсутствием влияния на него полярности окружения, что особенно важно при изучении локализации зонда в различных клеточных органеллах. Спектры флуоресценции (Ме4-БОЭ1РУ-8)-метки и поглощения МТХ не перекрываются.
Целевой продукт (VII) синтезировали согласно разработанной ранее для МТХ-ЭО схеме [11, 12], вводя в реакцию активированный эфир МТХ (VI) и БЭР-триглицерид (V) (схема). В качестве исходного вещества для получения синтона (V) использовали гас-изопропилиденглицерин. После его ацилирования Вос-Р-аланином удаление кетальной защиты с продукта проводили в достаточно мягких условиях (0.2 М НС1). Полученный моноглицерид (I) ацилировали 13-БЭР-тридека-новой кислотой (II) в присутствии ЭСС и основных катализаторов (реакция протекает преимущественно по первичному гидроксилу; 4-амино-пиридин позволяет ускорить ацилирование [20] и минимизировать образование продукта конденсации по двум ОН-группам). Диглицерид (III) ацилировали действием 1.5 экв. олеиновой кислоты и выделяли триглицерид (IV) гель-фильтрацией на липофильном сефадексе (выход 92%); все предшествующие продукты ацилирования выделяли хроматографией на силикагеле (выходы 3537%). Вос-защиту снимали в максимально мягких условиях (ТЕА, 0°С, 30 мин), чтобы избежать присоединения ТБА по двойной связи, а также деградации БЭР-группы. Однако такая деградация все-таки происходит (выход продукта 30%). Другие известные методы деблокирования Вос-группы (например, 98% НСООН) приводили к полному разрушению флуорофора. Спектр флуоресценции и УФ-спектр синтона (V) идентичны спектрам БОЭ^У-кислоты (II): (этанол) ^возб 497 нм, 506 нм; ^макс, нм (е): 498 (8.1 х 104 М-1 см-1).
СИНТЕЗ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛОГА ЛИПОФИЛЬНОГО ПРОЛЕКАРСТВА 127
-•OH OH
а, ^O
O '
OH
>7-
OH O (I)
NH-Boc
+ BDP-(CH2)12COOH
( II)
NH-Boc
OleO
(III) + OleOH
^^ ^NH-Boc BDP-(CH2)12COO O
(IV)
BDP-(CH2)12 COO
OleO
(III)
'O^ ^\^NH3CF3COO BDP-(CH2)12 coo o
(V)
H2N.___N.___.N Me
COOH
COOH
д, е
(V) + (VI)
MTX
COOH
O O
COOH
COOCH2COOC6H4-NO2-n (VI)
(VII)
(а) Boc-ß-аланин, DCC, 4-диметиламинопири дин, хлороформ; (б) 1 М HCl—MeOH, 1 : 4, 2 ч; (в) DCC, 4-аминопиридин, 4-диметиламинопиридин, хлороформ; (г) TFA; (д) CS2CO3/DMSO; (е) (п-нитрофенил)йодацетат; (ж) триэтиламин, DMSO.
BDP =
л-N+ F
V j- Ole = CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7CO
Схема.
На заключительной стадии гас-1-[13-(Ме4-ВОЭ1РУ-8)тридеканоил]-2-олеоил-3-(3-амино-пропионил)глицерин (V) ацилировали активированным эфиром (VI) в DMSO/TEA. Эфир (VI) получали взаимодействием цезиевой соли метот-рексата с 1.5 экв. (я-нитрофенил)йодацетата, как описано ранее: быстрое алкилирование (менее 5 мин) соли МТХ йодацетатом дает преимущественно у-моноэфир (у/а-моноэфир ~ 16.6) [12] (при длительной реакции с алкилбромидами доля диэфира значительно увеличивается [15]). Целевой продукт (VII) выделяли гель-фильтрацией на липофильном сефадексе с последующей хроматографией на силикагеле, элюируя смесью 10— 15% метанола в хлороформе с 1% АсОН и 1% воды (выход 26%; желто-зеленое аморфное вещество). 1Н-ЯМР-спектр (8, м.д.; КССВ - /, Гц) регистрировали на приборе Вгакег WM-700 (США) в смеси CDCl3-MeOH-flf4, 1 : 1, при 30°С, используя остаточные сигналы протонов растворителей (7.6 и 4.6 м.д.) в качестве внутреннего стандарта: 0.90
(м, 3 Н, СН3), 1.28 м (уш. м, 38 Н, С4-С7 и С12-С17 Ole, С4-С12 тридеканоил), 1.51 (квинтет, 2 Н, СОеН2СИ2), 1.64 (м, 2 Н, СОСН2СН2), 2.01 (м, 4 Н, СН2СНСН
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.