m
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 10, с. 795 - 801
УДК 577.113.3.057
СИНТЕЗ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ З'-КАРБАМОИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ТИМИДИНА
©1995 г. Ю. Г. Боресков, Ю. А. Берлин*
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, ¡17871, Москва„ ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 13.01.95 г.
Описан синтез ряда флуоресцентных З'-уретанов тимидина путем взаимодействия соответствующего З'-карбонилимидазолида с аминоалкильными производными флуоресцеина, аминофенилбензок-сазола и пирена.
Ключевые слова: флуоресцентные метки, карбонилдиимидазол, уретаны, нуклеозиды.
Цветовая дифференциация фрагментов ДНК с помощью флуоресцентных меток позволяет усовершенствовать многие молекулярно-биоло-гические методы анализа. Наиболее ярко это реализуется в однодорожечном секвенировании ДНК (полосы четырех цветов, отвечающих четырем различным нуклеотидным звеньям, в одной дорожке геля) [ 1 ] и селективной детекции точечных мутаций в медицинской диагностике [2]. Флуоресцентно детектируемые подинуклеотиды могут быть получены в качестве продуктов ДНК-полимеразной достройки 5'-меченых олигонукле-отидных праймеров [3] или же с использованием модифицированных по нуклеозидному остатку сМТР, блокирующих элонгацию цепи ДНК [4].
Меченые сНЧТР-терминаторы обладают рядом преимуществ по сравнению с мечеными прайме-рами. Прежде всего они универсальны, поскольку могут использоваться с любыми немодифици-рованными праймерами. К тому же реакции по-лимеразной достройки с участием нескольких терминаторов, меченных разными красителями, могут проводиться в одной реакционной смеси. Введение репортерных групп в с11ЧТР и праймеры по-разному сказывается на их субстратных свойствах по отношению к полимеразе. В то время как реакционная способность химически модифицированных праймеров практически не меняется, особенно в случае 5'-терминально меченных праймеров, специфичность нерадиоактивно меченных с1КГР значительно снижается. При этом существенное значение могут иметь положение репортерной группы в составе нуклеозидтрифос-фатов и ее свойства. Так, введение даже довольно объемистых заместителей по 5-му положению
Сокращения: FITC - флуоресцеинизотиоцианат, DMT - 4,4'-диметокситритил, DMF - диметилформамид, CDI - карбонилдиимидазол, DMAP - 4-(диметиламино)пиридин, FAB -ионизация ускоренными атомами.
* Автор для переписки.
пиримидина и по 7-му положению пурина все же не препятствует специфическому встраиванию соответствующих дидезоксинуклеотидов некоторыми ДНК~полимеразами в ходе матричной по-лимеразной реакции [5]. Аналогичные данные получены для некоторых производных дезокси-нуклеотидов по З'-гидроксилу [6].
В настоящей работе описываются синтез и спектральные свойства ряда З'-карбамоильных производных тимидина, замещенных по карбамо-ильной группе остатками флуоресцеина, амино-фенилбензоксазола или пирена, как потенциальных терминаторов при полимеразной достройке праймеров. Выбор флуоресцентных меток определялся не только их спектральными характеристиками, но и различной способностью к интерка-ляции в ДНК, что может влиять на субстратные свойства нерадиоактивно меченных (11ЧТР.
Соединения этого типа подобно другим аналогам 2'-дезоксинуклеозидов, модифицированным по З'-положению, интересны не только как реагенты для секвенирования ДНК, но и как потенциальные химиотерапевтические средства с противовирусной или противоопухолевой активностью (см., например, обзор [7]): так, известно, что наличие карбаматной функции способствует проникновению нуклеозидных аналогов через биологические мембраны и во многом определяет их фармакологическую активность [8]. Описана также иммобилизация нуклеозидов с помощью З'-уретановой группы на носителе для твердофазного олигонуклеотидного синтеза [9], однако метод не получил распространения из-за устойчивости этой группы при деблокировании водным аммиаком.
В качестве источника метки при синтезе флуоресцентных производных тимидина мы использовали аминоалкильные производные упомянутых выше красителей с линкерами различной
длины (соединения IX, X, XII, XIV, XVII, XX). Метки на основе флуоресцеина получали двумя путями: из ИТС (смесь 5- и 6-изомеров) и индивидуального 5-аминофлуоресцеина с защищенными гидроксильными группами (соединения V и VI). Так, из реакционной смеси, полученной в результате обработки ИТС М-трифторацетилгексаме-тилендиамином, хроматографически выделили 5-флуоресцеинильное производное (XIII) и после отщепления трифторацетильной группы мягким аммонолизом получили соответствующую ами-ногексилтиомочевину (XIV).
Исходным соединением для второй разновидности меток служил 5-нитрофлуоресцеин (1), полученный наряду с 6-изомером сплавлением резорцина и 4-нитрофталевой кислоты [10] и после ацетилировэния продуктов реакции и дробной кристаллизации выделенный в виде диацетата (Ш). Представлялось целесообразным при дальнейших превращениях сохранить О-ацетильные группы, чтобы снизить вероятность побочных реакций и улучшить растворимость красителя, Однако восстановление диацетата (III) действием Ка28204, ТЮ3 или 5пС12 в значительной степени сопровождалось дезацетилированием, и лишь использование в качестве восстановителя смеси тонкодисперсного алюминия и №С12 • 6Н20 [11] привело с высоким выходом к диацетату аминофлуоресцеи-на (V). Следует отметить, что соответствующий дибензоат (IV) при восстановлении двухлорис-тым оловом сохранял О-защитные группы.
Для введения в молекулу флуоресцеина линкера, содержащего алифатическую аминогруппу, которая предназначена для последующего связы-
вания с нуклеозидом, 5-аминофлуоресцеин с аце-тилированными или бензоилированными гидро-ксилами (соответственно соединения (V) и (VI)) №-ацилировали ¡Ы-Вос-защищенной 6-аминока-проновой кислотой и Вос-группу селективно удаляли смесью муравьиной и трифторуксусной кислот. В результате были получены со-аминоал-кильные производные (IX) и (X), использованные затем для введения остатка флуоресцеина в защищенный тимидин. Обработкой соединения (IX) активированным эфиром б-Р^-Вос-аминокапроновой кислоты с последующим деблокированием получили репортерную группу с удвоенным спейсером (ХП). Аналогично из аминофенилбензоксазола (XV) было получено аминокапроильное производное (XVII). Реагент (XX) для введения пиренильно-го остатка синтезировали путем мон^ацилирова-ния тетраметилендиамина пентафторфениловым эфиром 4-(1-пиренил)масляной кислоты (XIX).
З'-Карбамоильную группировку вводили в молекулу 5'-0-диметокситритилтимидина (XXI), активируя З'-гидроксил с помощью карбониЛди-имидазола. Этот реагент ранее использовался для двухэтапной дериватизации олигонуклеоти-дов [12]: сначала в олигонуклеотид вводили ами-нолинкер, содержащий также функциональные группы (тиольную [13], карбоксильную [14] или дополнительные аминоалкильные [15, 16]), по которым затем вводили репортерные группы. Мы нашли, что если репортерную группу сначала присоединить к аминосодержащему спейсеру, то продукт такого взаимодействия может реагировать непосредственно с активированным З'-гидроксилом; тем самым сводится к минимуму число реакций
(I) К = Н, Я1 =N02, Я2 = Н
(II) Я = Ас, Я' = Н, Я2 = МО;
(III) Я = Ас, Я1 = Ы02, Я2=Н
(IV) я = Вг, Я1 = ш2, я2 = н
(V) я = Ас, я1 = мн2, я2 = н
(VI) я = Вг, я1 = NH2, Я2 = Н
(VII) я = Ас, к1 = ШСО^Н^ШВос, Я2=Н
(VIII) и = Вг, я1 = ННСО(СН2)5ЫНВос, я2 = н
(IX) я = Ас, я1 = ШСО(СН2)5Ш2, Я2 = Н
(X) я = Вг, я1 = ННСО(СН2)5Ш2, я2 = н
(XI) я = Ас, я' = ШСО(СН2)5ШСО(СН2)5Г<НВос, Я2 = Н
(XII) я = Ас, я1 = ШСО(СН2)5ЫНСО(СН2)5НН2, я2 = н
(XIII) я = н, я1 = ШС5Ш(СН2)6ННСОСР.,, Я2 = Н
(XIV) к = н, я1 = МНС81МН(СН2)6МН2, Я2 = Н
(СН2)3СОЯ
(XV) я = н
(XVI) Я = СО(СН2)51ЧНСОСРз
(XVII) Я = СО(СН2)51ЧН2
(XVIII) я = он
(XIX) и = ОС6Б5
(XX) Я = ЫЩСН^Шг
Н,С
ЭМТО
О
ш
гАо
н,с
бю
», И, н +
о
ын
Н^Ч)
оя
(XXI) я = н
(XXII) Я = СОМ
ОСОШ-К'-]^ (ХХШа-д) Я = Н (XXIV) н = соын-к1-112
I = (XIV) (а), (IX) или (X) (б), (XII) (в), (XVII) (г), (XX) (д); и = ЫН4ОН (а - в)
(ХХШг, XXIV)
(ХХШа - в)
-(CH2)6NHCSNH- (а)
И1 -(СН2)5СОГ"Ш- (б)
-(СН2)5СОЫН(СН2)5СОКН- (в)
но. ^
-(СН2)5СОМН-
(ХХТИд) -(СН2)4МНСО(СН2)3-
к2
СООН
Схема.
с участием нуклеозида, который в общем случае является наиболее труднодоступным компонентом.
При З'-модификации защищенного тимидина
(XXI) (схема) его З'-О-карбонилимидазолид (XXII) вводили в реакцию с флуоресцентными метками, содержащими алифатическую аминогруппу. Оказалось, что аминогруппа спейсера, уже модифицированного репортерной группой, менее ре-акционноспособна по отношению к соединению
(XXII), чем такая же группа в составе незамещенного линкера, поэтому для полного протекания реакции потребовался основный растворитель и активатор. Лучшие результаты были получены при использовании пиридина и ОМАР (2 ч при комнатной температуре, 3-кратный избыток имидазо-лида (XXII) по отношению к аминокомпоненту, метод А). При проведении реакции в БМ!7 более эффективным активатором оказался тетразол, однако при этом образуется до 40% побочного продукта (метод Б). В УФ-спектре этого продукта, полученного при реакции в ЬмР З'-О-карбо-нилимидазолида тимидина (XXII) с бензоксазоль-ным производным (XVII), соотношение е320/е260 заметно выше, чем в случае конъюгата (ХХШг) -единственного продукта, образующегося при взаимодействии этих же соединений в пиридине. Это позволило предположить, что побочное вещество (XIV) представляет собой продукт 3',5'-бис-кар-
бамоилирования тимидина, по-видимому, образовавшийся в результате промежуточного 5'-детри-тилирования соединений (XXI) или (XXII) под действием тетразола и 3' —»- 5'-перекарбамоили-рования. Действительно, это вещество было получено из тимидина в результате его последовательной обработки СМ и тем же бензоксазоль-ным производным (XVII). Следует отметить, что ароматические амины с имидазолилкарбонилти-мидином (XXII) практически не реагируют.
Уретаны (ХХШ) были выделены препаративной ТСХ на силикагеле. Их строение было подтверждено с помощью спектральных данных. Масс-спектры дали ожидаемые пики молекулярных ионов (таблица). УФ-спектры (рис. 1 и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.