»
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 4, с. 296 - 300
УДК 547.979.733:547.466
СИНТЕЗ ФОСФОРЕСЦЕНТНЫХ МЕТАЛЛОПОРФИРИНОВ С ИЗОТИОЦИАНАТНОЙ ГРУППОЙ
© 1995 г. О. Н. Понаморева, В. Д. Румянцева, А. Ф. Миронов*, А. В. Чуди нов*
Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, Москва; * Государственный институт биологического приборостроения, Москва Поступила в редакцию 20.06.94 г.
В качестве потенциальных фосфоресцентных меток для белков синтезированы палладиевые комплексы 6,7-бис(Ка-лизино)мезопорфирина IX и его изотиоцианатного производного.
Ключевые слова: порфирины, палладиевые комплексы; лизин, изотиоцианатные производные; иммуноанализ фосфоресцентный.
Как известно, комплексы порфиринов с металлами (Рф Р1, ЯиШ), Со(Ш)) обладают интенсивной фосфоресценцией при температурах около 300 К [1], что позволяет использовать такие соединения в аналитической биохимии для маркировки биологических объектов. Измерение фосфоресценции металл окомплексов порфиринов, связанных с биологическими образцами, при комнатной температуре в импульсном режиме с отсечением короткоживущей люминесценции фона (анализ с временным разрешением) позволяет регистрировать малые и сверхмалые концентрации исследуемых белков [2].
Описано применение в иммуноанализе палла-диевого и платинового комплексов копропорфи-ринов, соединенных с белками карбодиимидным методом [3,4].
В настоящей работе для связывания порфиринов с белками был предложен иной подход. Нами был синтезирован палладиевый комплекс мезо-порфирина IX, содержащий изотиоцианатную группу, отделенную от порфиринового ядра остатком модифицированного лизина. Использование модифицированного лизина в качестве спейсера не увеличивает общей гидрофобности маркера и поэтому не должно приводить к увеличению его неспецифического связывания с белком.
Мезопорфирин IX и его палладиевый комплекс получали по методикам [5, 6], метиловый эфир ЬР-бензилоксикарбониллизина - так, как описано в работах [7, 8]. Для синтеза лизиновых производных Рё-мезопорфирина IX были использованы карбодиимидный и хлорангидридный методы. Модификация метода с водорастворимым карбодиимидом позволила легко удалять избы-
# Адрес для переписки: 117571, Москва, ул. 26 Бакинских комиссаров, д. 1, корп. 1, кв. 73, Миронову А.Ф.
ток как самого карбодиимида, так и продуктов его распада. Реакцию М-мезопорфирина IX (16) с метиловым эфиром №-бензилоксикарбониллизи-на проводили в безводном пиридине с двукратным избытком 1-цикл огексил-3-[2-(1-метил морфоли-ний)этил ] карбодиимид а-п-то л уол сул ьфоната,
В конденсацию хлорангидридным методом в качестве исходного вещества вводили мезопорфирин IX (1а). Его обработка тионилхлоридом приводила к соответствующему бисхлорангидри-ду, при взаимодействии которого с метиловым эфиром №45 е нзи л оксик ар б они л л и зина образовывался диметиловый эфир №-бензилоксикарбо-нил-№-лизиномезопорфирина (Па). Палладиевый комплекс получали кипячением аминокислотного производного (Па) в диметилформамиде с хлоридом палладия. После хроматографической очистки на силикагеле общий выход метилового эфира бис-№-бензилоксикарбонил -1Ча-ли:шно-Р<3-мезопорфирина (Нб) составил 58%, что выше выхода по первому методу с Использованием карбодиимида (45%). Структуры полученных соединений (На) и (Пб) были доказаны элементным анализом, 'Н-ЯМР-, ИК-, масс- и электронной спектроскопией. Электронный спектр полученного палладиевого производного идентичен спектру диметилового эфира Рс1-мезопорфирина.
Омыление сложноэфирных групп в соединении (Нб) проводили действием щелочи в тетраги-дрофуране, а №-бензилоксикарбонильную группу отщепляли раствором бромистого водорода в уксусной кислоте. После упаривания получали красный осадок, хорошо растворимый в воде, представляющий собой бис-Ь^-гидробромид Рё-бислизиномезопорфирина (Шб).
Соединение (Шб) показало хорошую фосфоресценцию в водных растворах при тщательном удалении кислорода. Оно хорошо растворимо
СИНТЕЗ ФОСФОРЕСЦЕНТНЫХ МЕТАЛЛОПОРФИРИНОВ
297
(Ia) М = 2Н (16) М = Pd
ZHN
NHZ
COOCHj
(IIa) М = 2Н (116) М = Pd
соосн,
(II б)
ноос
соон
NHR RHN
(Ша) R = Z (Ш б) R = Н
НООС
N=C=S
при рН < 7, удобно для получения конъюгатов с белками. Кроме того, известно, что аминокислотные производные порфиринов могут избирательно накапливаться в злокачественных образованиях, а их токсичность по сравнению с самими пор-фиринами при этом значительно снижается [9]. Следовательно, люминесценцию палладиевого комплекса лизинового производного мезопорфи-рина (Шб) удастся, по-видимому, использовать для диагностики раковых заболеваний.
Для достижения конечной цели - получения изотиоцианатного производного - водный раствор порфирина (Шб) подщелачивали до рН 8 и обрабатывали при интенсивном перемешивании тиофосгеном в хлороформе. После подкисления продукты реакции экстрагировали хлороформом и хроматографировали на силикагеле. В результате был получен диизотиоцианат порфирина (IV)
с выходом 28%. ИК~спектр подтвердил наличие изотиоцианатной группы. Высокочастотная полоса поглощения валентных колебаний органических изотиоцианатов находится в области 2020 - 2100 см-' и обычно представляет собой дублет или имеет плечо [10]. Именно такую интенсивную полосу поглощения с плечом в области 2100 см-1 мы обнаружили в ИК-спектре выделенного вещества (рис. 1), причем в спектре исходного вещества (Шб) эта полоса отсутствовала (рис. 2). Структура конечного продукта (IV) была также подтверждена данными масс-спектрометрии. Известно, что одним из ограничений порфириновых меток, не имеющих специальных группировок для связывания с белком, является то, что большое количество антител теряет активность в результате взаимодействия с карбодиимидом. Синтезированное нами изотиоцианатное производное
298 Л<
80 60 40 20
ПОНАМОРЕВА и др.
1ГЛ
-I_L.
J_I__|_L
J_L
-[
3000 2000 1500 см
Рис. 1. ИК-спектр изотиоцианатного производного (IV).
3000 2000
1500
см
Рис. 2. ИК-спектр Рс1-6,7-бис(№'-лизино)мезопорфи-рина IX (Шб).
палладиевого комплекса порфирина (IV), вероятно, позволит существенно снизить внутрибелко-вое ковалентное связывание и уменьшить дезактивацию антител.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Фосфоресценцию измеряли в водном растворе с добавлением сульфита натрия (2 мг/мл) на спектрофотометре Perkin-Elmer. Спектры 'Н-ЯМР получены на спектрометре Bruker MSL-200 (200 МГц) в дейтерохлороформе. Электронные спектры записаны на спектрометре Beckman DU-8B (США) и Shimadzu UV-240 (Япония). ИК-спектры снимали на спектрометре Shimadzu 1R-435 (Япония) в таблетках с КВг. Масс-спектры измерены на приборе МСБХ (НПО "Электрон", Украина), использующем метод плазменно-десорбционной масс-спектрометрии, основанной на бомбардировке образца осколками деления 252Cf в сочетании с время-пролетным анализатором [11]. Температуры плавления определяли на приборе Boetius (Германия). Для аналитической ТСХ применяли пластины Silufol UV-254. Колоночную хроматографию проводили на силикагеле L 40/100 мкм (Chemapol, Чехия), а препаративную ТСХ - на силикагеле L 5/40 мкм (Chemapol, Чехия).
6,7-Бисдиметнловый эфир (1Че-бензилоксикар-бонил-№-лизино)мезопорфирин IX (На). К 80 мг
(0.14 ммоль) мезопорфирина IX (1а) прибавляли 4 мл тионилхлорида, смесь выдерживали 2 ч при 20°С до полного растворения осадка и упаривали досуха. Полученный хлорангидрид сушили 2 ч при 40°С и 1 мм рт. ст. и затем обрабатывали раствором 180 мг (0.56 ммоль) хлоргидрата метилового эфира №-бензилоксикарбониллизина и
0.2 мл (1.41 ммоль) триэтиламина в 4 мл хлороформа. Реакционную смесь выдерживали 1 ч при 20"С, добавляли 30 мл хлороформа, промывали 30 мл 0.1 н. НС1, 50 мл воды, сушили сульфатом натрия и упаривали. Остаток очищали на колонке (100 х 35 мм) с силикагелем. Вещество (Па) элю-ировали смесью хлороформа и метанола (60 : 1). Выход 103 мг (65%), Л/0.36 (система хлороформ-метанол, 60 : 1). Электронный спектр (СНС13) [А^, нм (е х Ю-3, М'1 см"1)]: 400 (196.7), 497.5 (14.0), 534.2 (10.3), 565.8 (7.3), 619.2 (5.1). 'Н-ЯМР (6, м'. д.): 10.20,10.05,10.00 (1Н.2Н, 1Н,с,жезо-Н); 7.30 (5Н, м, С6Н5); 7.15 (4Н, м, СОШ); 4.78 (4Н, с, СН2С6Н5); 4-30 (4Н, кв, СН2СН3); 4.05, 4.03 (2Н, 2Н, т, СЫ2СН2СО); 3.65, 3.55, 3.53 (6Н, ЗН, ЗН, с, СН3); 3.60 (4Н, м, СН2СН2СН2СЩЧН); 3.40 (6Н, с, ОСН3); 3.30 (4Н, т, СН2СН2СО); 3.05 (2Н, м, ШСНСН2СН2СН2СН2); 1.80 (6Н, т, СН2СН3); 1.57 (12Н, м, СН2СН2СН2СН2Ш). Найдено, %: С 68.69, Н 7.03, N 9.60. Сб4Н78Ы8О10. Вычислено, %: С 68.67, Н7.02, N 10.01.
Палладиевый комплекс 6,7-бисдиметилового эфира (1ЧЕ-бензилоксикарбонил-1^а-лизино)мезо-порфирина IX (Пб). Способ 1. К раствору 38 мг (0.034 ммоль) лизинового производного мезопорфирина (Па) в 10 мл диметилформамида прибавляли 10 мг (0.51 ммоль) хлорида палладия. Реакционную смесь кипятили 45 мин, затем охлаждали и выливали в воду со льдом (200 мл). Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой и высушивали в вакуум-эксикаторе. Сухой остаток очищали на колонке (150 х 25 мм) с силикагелем. Вещество (Пб) элюировали смесью хлороформ-ацетон (10 : 3). Выход 37 мг (90"%>). Электронный
СИНТЕЗ ФОСФОРЕСЦЕНТНЫХ МЕТАЛЛОПОРФИРИНОВ
299
спектр (СНС13) [Хмзкс, нм (е х 1(Н, М"1 см-1)]: 392.5 (21.1); 545.8 (41.3); 511.7 (14.8). Масс-спектр, m/z■ 1223 (М+). 'Н-ЯМР (5, м. д.): 10.00, 9.95, 9.90, 9.85 (1Н, 1Н, 1Н, 1Н, с, мезо-П)- 7.30 (5Н, м, С6Н5); 7.18 (4Н, м, NHCO); 4.8 (4Н, с, СН2С6Н5); 4.2 (4Н, кв, СН2СН3); 3.95 (4Н, т, СН2СН2СО); 3.60, 3.55, 3".50 (6Н, ЗН, ЗН, с, СН3); 3.58 (4Н, м, CH2CH2CH2CH2NH); 3.40 (6Н, с, ОСН3); 3.20 (4Н, т, СН2СН2СО); 2.95 (2Н, м, NHCHCH2CH2CH2CH2); 1.80, 1.75 (ЗН, ЗН, т, СН2СН3); 1.60 (12Н, м, CH2CH2CH2CH2NH). Найдено, %: С 63.29, Н 6.24, N 9.46. C^H^NgO^d. Вычислено, %: С 62.81, Н 6.26, N 9.16.
Способ 2. К раствору 67 мг (0.1 ммоль) палла-диевого комплекса мезопорфирина в 1 мл сухого пиридина и 6 мл хлороформа прибавляли 128 мг (0.4 ммоль) гидрохлорида метилового эфира №-бензилоксикарбониллизина и 0.14 мл (1 ммоль) триэтиламина и раствор охлаждали до 5°С. Затем к нему при постоянном перемешивании прибавляли 127 мг (0.3 ммоль) п-толуолсульфоната 1-цикл оге
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.