БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 2, с. 156 - 157
ПИСЬМА РЕДАКТОРУ
УДК 578.891.083.3:577.112.6
СИНТЕЗ И АНТИГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕПТИДОВ ИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ БЕЛКА ОКЕЗ ВИРУСА ГЕПАТИТА Е
© 1995 г. Ю. А. Семилетов, Е. В. Дементьева, Т. Л. Яшина, М. О. Фаворов, В. А. Шибнев
НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16
Поступило в редакцию 29.07.94 г.
Ключевые слова: пептиды синтетические; антигенные детерминанты; вирус гепатита Е.
Вирус гепатита Е (HEV) - недавно открытый инфекционный агент энтерально передающегося гепатита ни А, ни В [1, 2]. Гепатит Е является серьезной проблемой во многих развивающихся странах, включая среднеазиатские регионы бывшего СССР [2]. В результате клонирования и последующего секвенирования генома HEV были идентифицированы три открытые рамки считывания (ORF) [2], в том числе ORF3, кодирующая белок, содержащий 123 аминокислотных остат-
Таблица 1. Характеристики синтезированных пептидов
Позиция пептида в белке ORF3 Данные аминокислотного анализа* ВЭЖХ**, время выхода, мин Выход***, %
92- 103 D 1.89(2); Т 0.90(1); S 0.95(1); Р 2.88(3); G 0.93(1); А 1.00(1); V 0.94(1); L 1.04(1); H 0.83(1) 6.3 25
99-116 Не определено 8.8 27
99-119 D 1.00(1); Т 0.96(1); S 0.94(1); Е 1.05(1); Р 5.86(6); G 0.91(1); А 1.00(1); V 2.84(3); L 3.94(4); H 0.86(1); R 0.85(1) 8.4 21
102-116 Не определено 7.1 28
102-119 То же 7.5 32
111 -123 D 0.98(1); Е 1.07(1); Р 3.00(3); G 1.11(1); V 1.86(2); L 1.87(2); H 0.86(1); R 2.11(2) 6.8 18
* Аминокислотный состав пептидов определяли на анализаторе Hitachi (Япония). Кислотный гидролиз проводили 6 н. НС1 при 110°С в течение 24 ч.
** Обращенно-фазовая ВЭЖХ на приборе Du Pont (США) в условиях: колонка Nucleosil С18, 7 мкм (10 х 250 мм; Macherey-Nagel, Германия), элюция 0.1% TFA в 30% ацетонитриле - 0.1% TFA в 60% ацетонитриле в течение 20 мин; скорость потока 4 мл/мин, детекция при 220 нм.
*** Выход пептидов определен в расчете на стартовую аминокислоту после очистки ВЭЖХ.
ка, функции которого пока не установлены. Недавно [3] один из иммунодоминантных участков ORF3 белка был выявлен между 91-м и 123-м аминокислотными остатками. Цель настоящего исследования - более точная локализация эпитопов в С-концевой части ORF3-6eTKa HEV с помощью синтетических пептидов.
Нами осуществлен синтез и исследованы антигенные свойства пептидов 92 -103,99 -116,99 -119, 102 - 116, 102 - 119, 111 - 123 из состава белка ORF3. Ниже приведены первичная и вторичная структуры выбранной для исследования последовательности 92 - 123:
92 100 110 120
N PPDHSAPLGVTRP SAPPLPHVVDLPQLGPRR
cttcccctttcccttcccccccccctttcccc,
где предсказанные по методу Птицина и Фин-келыптейна [4] элементы вторичной структуры обозначены как t (Р-изгиб), с (неупорядоченный клубок). Вторичная структура неупорядоченного участка 92 - 123 предполагает наличие четырех Р-изгибов в местах расположения остатков Pro, которые могли бы способствовать формированию антигенных сайтов.
Пептиды были синтезированы на твердой фазе (тефлон с радиационно привитым полистиролом) с использованием Boc/Bzl-етратегии, активированных эфиров и симметричных ангидридов В ос-аминокислот [5]. После отщепления от полимера действием трифторметансульфокислоты в трифторуксусной кислоте в присутствии тиоани-зола пептиды были очищены гель-хроматогра-фией на сефадексе G-10 и полупрепаративной об-ращенно-фазовой ВЭЖХ (табл. 1).
Свободные пептиды сорбировались на 96-лу-ночные планшеты в концентрации 5 мкг на лунку. Сыворотки исследовались в разведении 1 : 50 в условиях [3]. Отрицательным контролем служили сыворотки больных гепатитом А, гепатитом В
СИНТЕЗ И АНТИГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕПТИДОВ
157
Таблица 2. Взаимодействие синтезированных пептидов с сыворотками крови больных острым гепатитом Е*
Число сывороток
Антигены общее из них положительных
абсолютное количество %
92- 103 21 4 19.0
99-116 21 19 90.0
99-119 21 20 95.0
102- 116 21 17 81.0
102-119 21 19 90.0
111-123 21 5 24.0
Положительный контроль** 21 21 100.0
* Три образца сывороток здоровых доноров и по три образца сывороток больных гепатитом А или гепатитом В с исследованными пептидами не взаимодействовали.
** Диагностическая тест-система, предоставленная "Centers for Disease Control" (США).
и здоровых доноров. Положительными считались пробы, в которых значения относительного связывания Р/Ы были равны или более 3 (Р - значение поглощения (X 492 нм) в лунках с исследуемой сывороткой, N - значения поглощения отрицательных контролей) (табл. 2).
Из табл. 2 видно, что пептид 99 - 119 прореагировал со всеми сыворотками крови пациентов с диагнозом острый гепатит Е, кроме одной, ко-
торая не взаимодействовала ни с одним из исследуемых пептидов - вероятно, по причине отсутствия у данного пациента антител к С-концевой части СЖРЗ-белка, что согласуется с результатами, полученными Ю.Е. Худяковым и соавт. [3]. Несмотря на одинаковый процент положительных реакций, антигенные активности пептидов 99 - 116 и 102 - 116 несколько различались. Эти пептиды показали противоположные по значению результаты в реакциях с двумя анти-НЕУ-положитель-ными сыворотками: если один из указанных пептидов проявлял активность в отношении сыворотки, другой пептид с этой сывороткой не взаимодействовал. При уменьшении длины синтезированных пептидов снижался процент связывания с анти-НЕУ-антителами, причем "периферийные" пептиды 92 - 103 и 111 -123 обладают наименьшей антигенной активностью.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Reyes G.R., Purdy М.А., Kim J.P., Luk К., Young L.M., Fry H.E., Bradley D.W. // Science. 1990. V. 247. P. 1335 - 1339.
2. Bradley D.W. //Prog. Med. Virol. 1990. V. 37. P. 101 -135.
3. Khudyakov Y.E., Khudyakova N.S., Fields H.A., Jue D., Starling C., Favorov M.O., Kravczynski K., Polish L., Mast E., MargolisH. // Virology. 1993. V. 194. P. 89-96.
4. Ptitsyn O.B., Finkelstein A.V. // Biopolymers. 1983. V. 22. P. 15-25.
5. Семилетов Ю.А., Карпова В.А., Смирнов В.Д., Вязов С.О. // Биоорган, химия. 1993. Т. 19. № 3. С. 277 - 285.
Synthesis and Antigenic Activity of Peptides from the ORF3 Protein Sequence of Hepatitis E Virus
Yu. A. Semiletov, E. V. Dement'eva, T. L. Yashina, M. O. Favorov, and V. A. Shibnev
Ivanovsky Research Institute of Virology, Russian Academy of Medical Sciences, ul. Gamalei 16, Moscow, ]23098 Russia
Abstract - The hepatitis E virus (HEV) is an infection agent (detected recently) responsible for an enterically transmitted non-A, non-B hepatitis [1,2]. Hepatitis E is a big problem in many developing countries, including the Central Asian areas of the former Soviet Union [2]. By cloning followed by sequence analysis of the HEV genome, three open reading frames (ORF) have been identified, among them ORF3 encoding a protein containing 123 amino acid residues, the function of this protein being unknown. Recently [3], one of the immunodominant regions of ORF3 protein was revealed between the 91st and 123rd amino acid residue. The purpose of the present study was a more precise localization of epitopes in the C-terminal portion of HEV ORF3 protein by using synthetic peptides.
Key words: synthetic peptides; antigenic determinants; hepatitis E virus.
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 21 № 2 1995
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.