БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1997, том 23, № 11, с. 906-909
УДК 577.113.3.017
СИНТЕЗ И АНТИГЕРПЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ФОСФОРНЫХ ЭФИРОВ АЦИКЛОВИРА
© 1997 г. Г. А. Галегов#, В. М. Шобухов, Н. А. Леонтьева, М. В. Ясько*
Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16; * Институт молекулярной биологии им, В.А. Энгелъгардта РАН, Москва Поступила в редакцию 11.02.97 г. Принята к печати 20.05.97 г.
Осуществлен синтез фосфита и фторфосфата 9-(гидроксиэтилоксиметил)гуанина (ацикловира). Фосфит был получен обработкой ацикловира треххлористым фосфором в триэтилфосфате; для конденсации ацикловира с фторфосфорной кислотой использовали 2,4,6-триизопропилбешолсуль-фонилхлорид. Соединения охарактеризованы 'Н- и 31Р-ЯМР-, а также масс-спектрами. Показано, что они обладают способностью селективно подавлять репродукцию вируса герпеса простого, тип 1, о культуре клеток Vero, причем в случае фосфита ацикловира наблюдается значительная активность и в о тношении штамма вируса герпеса, резистентного к ацикловиру.
Ключевые слова: ациклические аналоги нуклеотидов; вирус герпеса простого; ацикловир.
В 80-х годах было показано, что ряд негидро-лизуемых ферментами фосфонатов ациклических нуклеозидов типа (Га) обладают высокой антивирусной, в том числе и антигерпесной, активностью {11. Это дало возможность создать препараты против многократно описанных штаммов вирусов герпеса, мутантных по тимидинкиназе и, таким образом, резистентных к известному противогер-песному препарату ацикловиру (ациклогуанози-ну) [2]. Однако такие соединения, превращаясь в соответствующие р,у-дифосфатные производные (16) за счет фосфорилирования клеточными ферментами [3], значительно теряли в селективности по отношению к клеткам, инфицированным вирусом герпеса, так как они ингибировали также и биосинтез клеточной ДНК в неинфицированных клетках. В то же время ацикловир (Па), фосфори-лируясь только в инфицированных вирусом герпеса клетках в трифосфатное производное (Пб) [4, 5], не только подавляет репродукцию этого вируса, но и при достаточно высоких концентрациях селективно убивает инфицированные вирусом клетки. С целью поиска производных ацикловира, также активных по отношению к мутантным штаммам вирусов герпеса и лишенных недостат-
Сокращения: BnT-l/Lj - вирус герпеса простого, тип 1; Bnr-l/L^/R - вирус герпеса простого, тип 1, резистентный к ацикловиру; ЦПД - цитопатогенное действие вируса; ИД50 и ИД95 - дозы, ингибирующие вирусное цитопатогенное действие на 50 и 95%; ЦТД50 - 50% цитотоксичес-кая доза для незаряженных клеток Vero; ИС - индекс селективности (отношение ЦТД5о к ИД50); БОЕ - бляшко-образующие единицы.
# Автор для переписки.
ков фосфонатов ациклических нуклеозидов (I), нами синтезированы и исследованы фосфорные эфиры ацикловира, которые содержат фосфит-ную (соединение (Ша)) и фторфосфагную (соединение (Шб)) группы.
О □
и И\/В R'0-PCH20 ¿ ^ (I)
ОН
R = Н, СН2ОН и др., В = Ade, Cyt, 2,4-диаминопурин-9-ил, (la) R' = Н; (16) R' = H306P2
Gua О Gua
I
(И) R
(III)
(IIa) R = H (ацикловир);
(116) R = H4O9P3 (Ша) R = H; (Шб) R = F
Ранее на примере фосфитов и фторфосфатов других нуклеозидов было показано, что они значительно стабильнее к дефосфорилированию фосфатазами и другими ферментами плазмы крови человека [6, 7], чем нуклеотиды с немоди-фицированной фосфатной группой.
Согласно данным табл. 1, соединения (Ша) и (Шб) подавляют продукцию ВПГ-1 в клетках Vero. Это означает, что предпринятый нами путь модификации молекулы ацикловира позволяет сохранить достаточно высокую антигерпетическую активность, которая носит выраженный селективный характер, на что указывают величины индексов селективности этих соединений,
Таблица 1. Действие модифицированных аналогов ацикловирмонофосфата на репродукцию ВПГ-1 в культуре клеток Vero
Соединение Цитотоксичность-ЦТД5о, мкМ Bnri/Lj ВПГ-1/L2/R
ИД50, мкМ ИД 95, мкМ И С ИД50, мкМ ИД 95, мкМ ис
(Ша) 3922 13.7 85.0 286 24.5 85.0 160
(Шб) 741 4.9 18.5 151 370.4 _* 2
Ацикловир (На) 533 1.9 11.1 281 400 _* 1
* Величина ИД95 для ацикловира и фторфосфата (Шб) не достигалась.
Таблица 2. Влияние ацикловира и его фосфорных эфиров на выживаемость (%) культуры клеток Vero, инфицированных ВПГ-1*
Незараженная культура клеток Зараженная культура клеток в отсутствие соединений Зараженная культура клеток в присутствии
(Ша) (Шб) ацикловира
88 11 80; 83** (81.7) 46; 50** (40.8) 79 (38.6) 49 (19.3) 88 (27.8) 64(13.9)
* Культура клеток Vero инфицировалась ТЗТ1Г- J/L^ через 36 ч роста; учет результатов через 48 ч после инфицирования клеток. В скобках указаны концентрации соединений (мкМ). '* Штамм Bnr-l/Lj/R.
сравнимые с наблюдаемыми для ацикловира. Хотя активность соединений (Illa, 1116) на чувствительном к ацикловиру штамме ВПГ-1/Ь2 по величине ИД50 в 3-6 раз ниже, чем у ацикловира, их токсичность по сравнению с ацикловиром значительно понижена. Более интересными представляются нам результаты, полученные на резистентном к ацикловиру штамме Bnr-1/L2/R. Для соединения (Ша) в отношении этого штамма наблюдалось лишь двукратное снижение активности, тогда как для ацикловира - в 200 раз. Соединение (Шб) оказалось мало активным в отношении ацикловир-резистентного штамма. Эти данные могут быть объяснены особенностью молекулярного механизма действия фосфита (Ша). Очевидно, что гидролиз фосфоэфирной связи соединения (Illa) с образованием ацикловира в клетках не объясняет полученные данные, так как в этом случае активность соединения (Ша) не должна превышать активность ацикловира. Можно полагать, что фосфит (Illa) либо непосредственно превращается в р,у-дифосфат (IV) (схема), либо в процессе диффузии в клетку окисляется в ацик-ловирмопофосфат (V) с последующим фосфори-лированием клеточными ферментами с образованием трифосфата (.116). Нам представляется более вероятной схема ингибирования репликации вируса с участием фосфитдифосфата (IV), так как в случае образования монофосфата (V) низкая токсичность фосфита (Ша) необъяснима. Мы полагаем, что в основе антигерпетического дей-
ствия соединения (Ша) может лежать механизм, аналогичный действию ацикловира.
(Ша)
0 о О
II II II
НО -р-о-1 -р-о I -р-о
он он н
0 1 j
НО -р-о- П п Gua
он
(IV)
Gua
J \
(115)
(V)
Из рисунка видно, что все исследованные соединения эффективно снижают инфекционный титр вируса в диапазоне нецитотоксических концентраций. Однако по этому показателю ацикло-
7 г 6.65
Влияние ацикловира (1) и его фосфорных эфиров (Шб) (2) и (Ша) (3,4) на инфекционный титр ВШЧ/Ьг (/-J) и Bm-l/Lj/R (4).
908
ГАЛЕГОВ и др.
вир, как имеющий минимальную величину ИД50, проявляет наибольшую активность. Таким образом, антивирусный эффект изучаемых соединений может быть представлен в виде ряда ацикловир > > (Шб) > (Ша). Тем не менее величины снижения инфекционных титров у всех трех соединений достаточно близки.
Благодаря противовирусному действию соединения (Ша, Шб) обладают "терапевтическим" эффектом в отношении культуры клеток Vero, инфицированных вирусом (табл. 1, 2). Все три соединения подавляют репродукцию ВПГ-1 и, таким образом, значительно увеличивают количество живых клеток по сравнению с инфицированными культурами клеток, не обработанными анализируемыми соединениями, когда количество живых клеток составляло ~11%.
Полученные результаты показывают, что предлагаемый нами путь модификации монофосфата ацикловира для создания ингибиторов репродукции вируса герпеса достаточно перспективен.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Соединение (Illa) ранее было синтезировано A.A. Хорлиным и соавт. [8], и были получены предварительные результаты о его антигерпетическом действии.
Использовали DEAE-целлюлозу (НС-форма) DE-32 (Whatman); 2,4,6-триизопропилбензол-сульфонилхлорид (TPS-C1); силикагель LiChro-ргер RP-18 (25-40 мкм; Merck); треххлористый фосфор (Fluka); триэтилфосфат, пиридин и DMF (Aldrich).
ЯМР-спектры регистрировали на приборе ßruker WP-200 SY (США) с рабочей частотой 200.13 МГц (внутренний стандарт - шреш-бутило-вый спирт) для 'Н-ЯМР и 81 МГц (с подавлением спин-спинового фосфор-протопного взаимодействия, внешний стандарт - 85% фосфорная кислота) для 31Р-ЯМР, в качестве растворителя использовали D20. Масс-спектры в режиме FAB (бомбардировка ускоренными атомами) регистрировали на спектрометре Kratos MS-50TC в глицериновой матрице.
Фосфит ацикловира (Ша), аммониевая соль.
К охлажденной до 0°С суспензии 90 мг (0.4 ммоль) ацикловира (IIa) в триэтилфосфате (1 мл) прибавляли 174 мкл (2 ммоль) РС13, выдерживали 6 ч при 5°С и 2 ч при 20°С. Реакционную массу нейтрализовали прибавлением 0.5 М ТЕАВ (12 мл), упаривали, разбавляли водой до 100 мл и наносили на колонку (10 х 2.5 см) с DE-32, промывали колонку водой (200 мл) и элюировали в линейном градиенте концентрации NH4HC03 (0 — 0.15 М, V 1.5 л). УФ-поглощающие фракции (при А, 254 им) концентрировали, упаривали с водой в вакууме и оста-
ток дополнительно очищали на колонке (2 х 20 см) с LiChroprep RP-18 с элюцией водой. Фракции, содержащие фосфит (Illa), лиофильно высушивали. Выход 78 мг (64%). 'Н-ЯМР (5, м. д., J, Гц): 7.91с (1Н, Н-8), 6.56д (1Н, /11Р 640 Гц, Н-Р), 5.42с (2Н, CH2Gua), 3.85м (211, СН2ОР), 3.67м (2Н, СН2ОС). 31Р-ЯМР (5, м. д.): 7.2с. Масс-спектр, m/z: 290 (МН+).
Фторфосфат ацикловира (Шб), аммониевая соль. К раствору 50 мг (0.22 ммоль) ацикловира (Па) в смеси 1 мл пиридина и 1 мл DMF прибавляли раствор 67 мг (0.67 ммоль) фгорфосфорной кислоты в 1 мл DMF и 133 мг (0.44 ммоль) 2,4,6-триизо-пропилбензолсульфонилхлорида, перемешивали 18 ч при 20°С. Разбавляли реакционную массу 50 мл воды и наносили на колонку с DE-32, далее поступали как в случае (lila). Выход 36 мг (52%). 'Н-ЯМР: 7.87с ( 1Н, Н-8), 5.48с (2Н, CH2Gua), 4.12м (2Н, СН2ОР), 3.83м (2Н, СН2ОС). 31Р-ЯМР: -4.90д, ^р р 933 Гц. Масс-спектр, miz:. 308 (МН+).
Эксперименты в клеточных системах. Использовали культуру клеток Vero (клетки почек африканских зеленых мартышек), полученных из лаборатории культуры тканей Института вирусологии РАМН. Клетки поддерживали в среде Игла MEM, содержащей 5% эмбриональную сыворотку телят
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.