w
Б И О ОРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 19 * № 1 * 1993
УДК 577.175.82.15 : 577.151.7
© 1993 И. А. Прудченко, Л. В. Сташевская, И. И. Михалева, В. Т. Иванов, А. А. Шандра *, Л. С. Годлевский *, А. М. Мазарати *
СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЯДА НОВЫХ АНАЛОГОВ
ПЕПТИДА ДЕЛЬТА-СНА I. АНТИЭПИЛЕПТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ
Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина РАЯ, Москва;
* Одесский медицинский институт им. Н. И. Пирогова, Одесса
С целью дальнейшего структурно-функционального изучения пептида дельта-сна (ДСИП) осуществлен синтез 11 новых аналогов пептида с помощью твердофазного способа синтеза по Ртос-и Вос-схемам. Модификации проводились в положениях 1, 2, 6 аминокислотной последовательности ДСИП. Проведено изучение антиэпилептической активности соединений в сравнении с нативным пептидом при внутримозговом (50 мкг/кг; на крысах) и внутрибрюшинном (1,0 мг/кг на мышах) введении в условиях острых форм генерализованной эпилептической активности, вызванной введением животным пикротоксина и коразола. Для ряда аналогов обнаружена антиэпилептическая активность, превышающая активность самого ДСИП как при внутримозговом, так и при внутрибрюшинном введении.
Пептид дельта-сна (ДСИП) был выделен из диализата венозной крови кроликов, таламическая область мозга которых была подвергнута низкочастотной электростимуляции, вызывающей медленноволновой сон (дельта-сон) [1 ]. Эндогенный пептид, обладающий сониндуцирующей активностью, привлек внимание физиологов, биохимиков и фармакологов. Но неоднозначность в результатах тестирования его гипногенной активности стала причиной некоторого скептицизма и известного падения интереса к изучению пептида. Однако своеобразный период некоторого «застоя» не был продолжительным, о чем свидетельствует большое число публикаций, посвященных различным аспектам исследования этого пептида с программирующими функциями, обобщенных в обзорах М. Графа и А. Кэстина 12] и Ш. Иноэ [3].
В настоящее время уже сложилось представление о пептиде дельта-сна как о нейропептиде с широким спектром биоактивности. Помимо неоднозначного действия на сон этот пептид уменьшает двигательную активность животных, влияет на терморегуляцию и циркадные ритмы, изменяет концентрацию нейромедиаторов и нейропептидов, вызывает налоксон-чувствительную анальгезию, обладает выраженной стресс-протективной и адаптогенной активностью.
Изучение влияния ДСИП на очаговые формы судорожной активности,
В работе использованы стандартные сокращения, рекомендованные комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC — IUB, а также: ДСИП — дельта-сониндуцирующий пептид; HOBt — 1-гидроксибензотриазол; TFA — трифторуксусная кислота; Раш — и-гидроксиметилфенилацетамидо-метил; сНх — циклогекенл; Z(Br) — 2-бромбензилоксикарбонил; Fmoc — 9-флуоренилметилоксикар-бонил; DIEA — диизопропилэтиламин; DMA — диметилацетамид; ВОР — гексафторфосфат бензотриазолил-Г*)-окситрисдиметиламинофосфония.
а также на судорожную активность, формируемую при коразоловом киндлинге, выявило противоэпилептическую эффективность ДСИП [4]. Исследованы особенности противосудорожных эффектов ДСИП на моделях генерализованных судорог, вызываемых разными эпилептогенами. Показаны противоэпилептические эффекты ДСИП в условиях создания эпилептических очагов в коре головного мозга крыс и кошек с помощью аппликации растворов пенициллина и стрихнина [5 ]. Показано также, что введение ДСИП в ретикулярную часть черной субстанции оказывает противосудорожное действие в условиях острых генерализованных судорог, вызываемых системным введением пикротоксина и коразола у интактных крыс, и выражается в удлинении латентного периода судорог, снижении их тяжести, а также снижении летальности животных в ответ на тестирующее применение конвульсанта [6, 7 ].
Настоящая работа посвящена исследованию противосудорожных свойств структурных аналогов ДСИП (II—XII) с заменами в положениях 1, 2 и 6 аминокислотной последовательности нативного пептида (I):
(I)
1 23 45 6 7 89
DSLP Trp-Ala--Gly--GIy--Asp~Ala--Ser-Gly--Glu
ID-1 -----DVal------------------------------------------------------------------------------------------(II)
ID-3 -----DAla---------------------Туг-------------------------(Ill)
ID-4 -----DLeu----------------------------------—.....- (IV)
ID-5 Tyr-Pro------------------------------------------------------------(V)
ID-7 - -DAla---------------------Pro—.........................(VI)
ID-8 Tyr-DAla---------------------------------------------------------(VII)
ID-9 —NMeAla-----------—---------------------------------------------------(VIII)
ID-10 -—-DAla---------------------------------(DC)
ID-11 ......Pro-------------..........Pro..................- (X)
ID-12 —,9 Ala...................................................(XI)
ID-13 -----DPhe.....-...................................................(XII)
Для увеличения устойчивости к протеолизу нами получен ряд аналогов с D-и NMe-аминокислотами в положении 2; исследована возможность замены триптофана на другую ароматическую аминокислоту*— тирозин в положении 1 ; проведена стабилизация молекулы за счет введения пролина в положения 2 и 6; получен ряд соединений с увеличенной липофильностью в положении 2,
Синтез аналогов осуществляли методом последовательного наращивания пептидной цепи с использованием Fmoc- и Вос-схем твердофазного пептидного синтеза. В случае синтеза по Вос-схеме для временной защиты ¿¡¡-аминогруппы аминокислот использовали Вос-группу. Боковые функциональные группы аминокислот защищали: Asp — ОсНх; Glu — OBzl; Ser — Bzl, Туг — Z(Br), Bzl. В качестве носителя использовали аминометилированный сополимер полистирола и I % дивинилбензола с РАМ-якорной группировкой. Для проведения реакций конденсации использовали диизопропилкарбодиимид в присутствии HOBt. В случае проведения конденсации с N-метилаланилполимером применяли ВОР-реагент в присутствии HOBt. Для наиболее полного протекания реакции брали 3-кратные избытки реагентов по отношению к псптидил-полимсру. Полноту протекания реакции контролировали с помощью качественного и количественного нингид-ринового теста [8 ]. В процессе синтеза аналогов нами был проведен поиск оптимального времени конденсации с помощью этого теста на каждой стадии синтеза. В табл. 1 представлены результаты этого поиска.
Для конечного деблокирования пептидов использовали жидкий фтористый водород в присутствии п-крезола (9 : 1); в случае триптофансодержащих пептидов в реакционную смесь добавляли 2% индола или триптофана. По данным ВЭЖХ для реакционной смеси,можно предположить, что выбранные условия деблокирования позволяют свести к минимуму протекание побочных реакций, связанных с наличием в пептидах триптофана и тирозина. При этом оказалось предпоч-
Оптимальное время конденсации на каждой стадии синтеза
Номер остатка Вводимый остаток Вос-схема Fmoc-схема
количество раз время, ч время, ч
8 Gly 1 2 2
7 Ser 1 1 1
6 Ala, Туг, Pro 1 1 1
5 Asp 1 1 1
Asp на Pro 1 2 2
4 Gly 1 2 1
3 Gly 1 2 2
2 .DAla, /Ша 1 2 2
Pro 2 1 2
DVal, /Дли 2 2 —
1 Trp, Tyr 2 1 2
Trp, Туг на Pro 2 2 4
Trp на NMeAla * 1 4 —
* Конденсация проводилась в ручном режиме с помощью ВОР-реагента.
тительнее использовать индол, поскольку при последующей гель-фильтрации удается полностью от него избавиться.
В случае синтеза по Fmoc-схеме для временной защиты а-аминогруппы аминокислот использовали Fmoc-группу, для защиты боковых функций — трет-бутильные группы. В качестве носителя применяли я-гидроксиметилфенилокси-метилполистирол. Для увеличения скорости протекания реакции конденсации нами применялись 4-кратные избытки реагентов. Для синтеза по Fmoc-схеме, так же как и в случае синтеза по Вос-схеме, определяли оптимальное время конденсации на каждой стадии синтеза с помощью нингидринового теста (табл.
< 1).
Для конечного деблокирования пептидов использовали три различных реагента. Применение реагента R (TFA — тиоанизол — этандитиол — анизол, 90 : 5 : 3 : 2) [9 ] привело к трудноразделимой смеси продуктов с содержанием целевого продукта не более 60% (по данным ВЭЖХ для реакционной смеси после гель-фильтрации; рис. 1а). Этот реагент был выбран исходя из литературных данных о предпочтительности использования этандитиола в смеси с другими «скевенджерами» для подавления алкилирования триптофана в случае триптофансодержащих пептидов [9]. При использовании реагента К (TFA — фенол — вода — тиоанизол — этандитиол, 82,5 : 5 : 5 : 5 : 2,5), предложенного в работе [10], результаты деблокирования оказались существенно лучше (рис. 16), однако остались трудности с выделением пептидов из реакционной смеси. В этих двух случаях оказалось недостаточно очистки гель-фильтрацией и пришлось использовать препаративную ВЭЖХ на конечной стадии очистки. С целью избежать дополнительных стадий очистки нами использован реагент A (TFA — хлороформ — индол, 75:23:2). Деблокирование проходило в течение 3 ч при 5° С с последующим упариванием на роторном испарителе при комнатной температуре. Этот реагент позволяет практически полностью избежать протекания побочных реакций при деблокировании (по данным ВЭЖХ; рис. 1<з) и выделить желаемый продукт за одну стадию очистки.
Для выделения деблокированных пептидов, полученных по Вое- и Fmoc-ехемам, мы использовали гель-фильтрацию на сефадексе G-15. Для большинства аналогов (см. табл. 2) этой стадии очистки оказалось достаточно, чтобы получить гомогенные
О 10 20 О ю 20 о Ю 20 МИН
Рис. 1. Аналитическая ВЭЖХ целевого продукта при синтезе по Ртос-схеме аналога (XI) после гель-фильтрации реакционной смеси при деблокировании реагентом Я (ТРА — тиоанизол — этандитиол — анизол, 90 : 5 : 3 : 2) (а), реагентом К ПТА — фенол — вода — тиоанизол — этандитиол, 82,5 : 5 : 5 : 5 : 2,5) (б) и реагентом А (ТРА — хлороформ — индол, 75 : 23 : 2) (в). Скорость элюции 1 мл/мин
Аналоги, полученные по Вое- и Ртос-схемам
Номер пептида Шифр Конечная стадия очистки Выход, %
Вос-схема Fmoc-ехема
I DSIP G-15 61 57
II ID-1 G-I5 52 —
III Ш-3 G-15 47 —
IV ID-4 ВЭЖХ * 49 —
V ID-5 G-15 63 67
VI ID-7 G-15 56 62
VII ID-8 G-15 51 58
VIII I
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.