т
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, М 2, с. ¡33 - 138
УДК 547.963.4.057:541.144.7:543.426
СИНТЕЗ И ФОТОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДИАД ТИПА АМИНОКИСЛОТА-ПОРФИРИН
© 1995 г. Р. П. Евстигнеева, С. Е. Грибкова, В. Н. Лузгина, В. 3. Пащенко*,
В. Б. Тусов*, Б. Н. Корватовский*
Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова; * Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 10.06.94 г.
Осуществлен синтез порфиринов, ковалентно связанных с аминокислотами Туг и Тгр. Показано образование состояний с разделенными зарядами в диадах типа аминокислота-порфирин при импульсном возбуждении в полосу поглощения порфирина. Методом кинетической флуоресцентной спектроскопии высокого временного разрешения определены константы скоростей и квантовые выходы образования состояний с разделенными зарядами и времена (константы скоростей) рекомбинации зарядов.
Ключевые слова: фотосинтез, порфирины, аминокислоты, перенос энергии, разделение зарядов.
Химическое моделирование отдельных стадий фотосинтеза позволило установить пути переноса энергии и электрона от фотовозбужденного пигмента на акцептор - хинон, а также участие донорных молекул каротиноидов, ароматических и алифатических аминов в состояниях с разделенными зарядами [1 - 5]. В настоящее время выяснение механизмов пигмент-белковых взаимодействий, реализуемых в различных фотосинтезирую-щих организмах, представляет собой одну из ключевых задач [6, 7]. Известны данные, позволяющие предполагать вовлечение аминокислотных фрагментов белков в качестве донорных компонентов в состояниях с разделенными зарядами [8], а также реализовать перенос энергии с хромофора на хромофор через пептидный мостик [9, 10]. Для подтверждения функции белка в процессе переноса электронов и энергии при фотосинтезе необходимо дальнейшее исследование модельных систем, и в первую очередь диад, включающих пигмент и аминокислоту. При этом можно надеяться на количественную оценку различных аминокислот как донорных компонентов при первичном разделении зарядов.
Порфириновые компоненты представлены 5-аминофенил-10,15,20-трифенилпорфирином (I) и 2-(2-карбокси)винил-5,10,15,20-тетрафенилпор-фирином (V), а аминокислоты - тирозином и триптофаном. Последние, поглощая в УФ-облас-ти спектра, наиболее предпочтительны для изучения процессов переноса электрона и энергии и, кроме того, могут послужить в качестве донор-
* Адрес для переписки: 117571, Москва, пр. Вернадского, 86, МИТХТ, Р.П. Евстигнеевой.
ных компонентов при создании в дальнейшем фотосинтетических систем, моделирующих первичные процессы фотосинтеза.
Ковалентное связывание порфиринов с аминокислотами достигнуто реакцией ацилирования. В результате хромофоры оказываются соединенными гибкой связью и перенос электрона может осуществляться как по связям, так и через пространство при реализации соответствующей кон-формации. Следует отметить, что ацилирование тирозина карбоксипорфирином проводили и ранее [11 - 13].
Синтезы соединений (I) - (III) были описаны в работе [14]. Амид (II) получали двумя способами: с использованием в качестве активирующих агентов изобутилхлорформиата и ЭСС; выходы составляли 26.6 и 75% соответственно. Удаление защитных группировок с тирозилпорфирина (II) достигалось действием трифторуксусной кислоты с 92% выходом соединения (III) (схема 1) [14]. Аналогичным путем исходя из 5-(п-аминофенил)-10,15,20-трифенилпорфирина (I) и Вос-защищен-ного триптофана получили соединение (IV) с выходом 71%.
Взаимодействие 2-(2-карбокси)винил-5,10,15,20-тетрафенилпорфирина (V) и гидрохлорида метилового эфира тирозина с применением ЭСС привело к соединению (VI) (схема 2) с выходом 40%. При аналогичной конденсации порфирина (V) с метиловым эфиром триптофана образовалось соединение (VII) с выходом 38.7%.
Структура всех полученных соединений подтверждена данными УФ-, ИК-, 'Н-ЯМР-спектро-скопии и масс-спектрометрии. Для диады (III)
II: Я = Вое III: К = Н
Схема 1.
соон
о
II
Я = ВосНЫ-СНС-
I
сн7
СОЯ'
о
о
VI Я'
-ИНСНСОСНз
он
VII Я' = -ОДСНСОСН-,
I
сщ
Схема 2.
Рис. 1. Схематичеркое изображение предпочтительной конформации соединения (III), полученное методом компьютерного моделирования.
была определена предпочтительная конформа-ция методом компьютерного моделирования (программа "Chem 3D Plus I" 3.0) как "сложенная" (рис. 1,2). Это коррелирует с данными о наличии "сложенной" конформации у порфирин-хинонов, полученных на основании изучения спектров ПМР [15].
При исследовании фотохимических свойств полученных диад методом стационарной флуоресцентной спектроскопии отмечено усиление интенсивности флуоресценции на 37% для соединений (II) и (VI) по сравнению с исходными пор-фиринами (I), (V).
Снятие защитных mpem-бутильных группировок с остатка тирозина приводило к увеличению флуоресценции соединения (III) на 79%. В случае соединений (IV) и (VII) выход флуоресценции увеличивался на 22 и 15% по сравнению с исходными порфиринами (I), (V), что свидетельствует о значительном влиянии аминокислот на процессы дезактивации синглетного состояния порфирина.
При изучении реакций образования состояний С разделенными зарядами измеряли кинетики затухания флуоресценции синтезированных соединений.
Установлено, что кинетики затухания флуоресценции порфиринов (I, рис. 3) и (V, рис. 4) моноэкспоненциальны, длительности флуоресценции (т) составляют 4 4 и 6.3 не соответственно. Кинетики затухания флуоресценции соединений (II, IV, рис. 3) и (VI, VII, рис. 4) двухкомпонентны, длительности (т12) и амплитуды (Л( 2) компонент приведены в таблице. Для объяснения двухком-
Фотофизические данные*
и К X ■и X S Е£ 'Cinc ч, НС ¿i ¿2 к{х 10"8, с"1 коХ 10"7, " с"1 Фт Е, эВ
ю
и
II 410 8.8 0.79 0.21 22 11.1 0.90 2.03
IV 270 8.5 0.86 0.14 35 11.7 0.94 2.03
VI 3000 10.8 0.7 0.3 1.7 9.2 0.42 2.01
VII 620 9.1 0.81 0.13 16 11 0.8 2.03
* Т] - время образования состояния с разделенными зарядами; т2 - время рекомбинации; А1 _ 2- относительные амплитуды компонентов кинетики затухания флуоресценции; кх - константа скорости образования состояния с разделенными зарядами; к2 - константа скорости рекомбинации; фт - квантовый выход.
Рис. 2. Молекулярная структура соединения (III).
Рис. 3. Кинетика затухания, флуоресценции соединений (I), (II), (IV) в метаноле, с 10"5 М, \тб 530 нм, A^uj. > 580 нм: 1 - аппаратная характеристическая функция, 2 - (I), 3 - (IV), 4 - (II).
понентного характера кинетики флуоресценции предполагается, что быстрая компонента соответствует времени образования состояния с разделенными зарядами, медленная - времени рекомбинации этих состояний. Сокращение времени жизни флуоресценции хромофора от единиц наносекунд (соединения I, V) до сотен пикосекунд (•Т[ для соединений П, IV, VI, VII) позволяет определить константы скоростей образования состоя-
« О)
Рис. 4. Кинетика затухания флуоресценции соединений (V), (VI), (VII) в метаноле, с Ю-5 М, \оз6 532 нм, Арег > 580 нм: 1 - аппаратная характеристическая функция, 2 - (V), 3 - (VI), 4 - (VII).
ний с разделенными зарядами (кх) и квантовые выходы этих реакций (<pm) из соотношений
= l/ti-Uch
где Хк1 - сумма констант скоростей внутримолекулярной релаксации синглетного возбуждения состояния порфирина в отсутствие процессов
разделения зарядов. Yk, = 1/т (х - длительность флуоресценции порфиринов (I, V)).
Квантовые выходы колеблются в пределах 0.42 - 0.94. Таким образом, белок может играть существенную роль в природных фотосистемах при реализации состояний с разделенными зарядами.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Конденсации осуществляли в безводных растворителях. Индивидуальность полученных соединений и ход реакции контролировали ТСХ на пластинках Silufol UV-254 (Kavalier) в следующих системах: хлороформ-метанол, 10 : 0.5 (А), эфир (Б), хлороформ-метанол, 4 : 1 (В).
Очистку веществ проводили колоночной хроматографией на силикагеле L 100/160. Дополнительную очистку осуществляли препаративной ТСХ на пластинках с кизельгелем G 60 (Merck) (20 х 20 см).
Электронные спектры регистрировали на приборе Beckman DU-6, Hitachi UV-557, ИК-спектры -на спектрофотометре Shimadzu IR-435, спектры флуоресценции - на спектрофлуориметре Hita-chi-850.
'Н-ЯМР-спектры получены на приборе Brucker WM-250. Масс-спектры регистрировали на спектрометре МСБХ методом времяпролетной масс-спектрометрии.
5-(и-Амилофенил)-10Д5,20-трифенилпорфирин (I), 5-[л-№(№-т/?ет-бутилоксикарбонил-0-трет-бутилоксикарбонилтирозил)аминофенил]-10,15,20-трифенилпорфирин (II), 5-(я-1Ч-тирозиламино-фенил)-10,15,20-трифенилпорфирин (III) синтезировали по описанной методике [14].
Кинетики затухания флуоресценции регистрировали на лабораторном пикосекундном импульсном флуорометре, описанном ранее [16]. Для возбуждения флуоресценции использовали одиночные импульсы света с длиной волны 266 и 532 нм, длительность которых на полувысоте составляла 30 пс. Флуоресценцию регистрировали с помощью электронно-оптической камеры "Агат СФ-ЗМ", сопряженной с видиконом и компьютером IBM PC AT. Система регистрации позволяет одновременно регистрировать аппаратную характеристическую функцию флуорометра (АХФ) с кинетикой затухания флуоресценции, производить отбор импульсов возбуждения по энергии и длительности, накапливать экспериментальные данные до заданного отношения сигнал/шум, выполнять математический анализ данных.
Математическую обработку кинетик затухания флуоресценции осуществляли сверткой модельной кривой вида
Ф(0 = 1(0)(А]е~'/х' + Аге~'/Тг) с аппаратной характеристической функцией.
В уравнении %, 2 и A ¡ 2 - длительности и амплитуды компонентов кинетики затухания флуоресценции, Л, + А2 = 1 для t > 0.
5-[ra-N-(Na-m/jem-6ymioKCHKap6oHRii-L-TpHiiTo-фил)аминофенил]-10,15,20-трифенилпорфирин (IV).
Раствор 0.04 г порфирина (I), 0.04 г Boc-L-Trp и 0.08 г DCC в 10 мл хлористого метилена перемешивали при 20°С в течение 2 ч. Образовавшуюся дициклогексилмочевину отделяли, реакционную массу промывали 5% раствором бикарбоната натрия. Растворитель удаляли в вакууме. Остаток очищали препаративной ТСХ на пластинках с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.