В связи с этим цель настоящей работы - изучение зависимости транспортных свойств системы полимер-белок и биологической активности иммобилизованного соединения от строения системы и состава водного раствора, в котором ей предстоит функционировать. В качестве белка в работе использован овомукоид из белка утиных яиц - гликопротеин, основная биологическая функция которого заключается во взаимодействии с протеолитическими ферментами с инги-бированием их активности, а в качестве полимера носителя - сополимеры ^^диэтилакриламида (ДЭАА) с АФИ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Синтез полимерных систем для термоактиви-руемого направленного транспорта обычно включает две стадии. На первой стадии получают активированные полимерные носители, способные реагировать с молекулами лекарственного препарата и имеющие НКТС, несколько превышающую физиологическое значение, а на второй стадии проводят иммобилизацию лекарства на этом носителе.
В настоящей работе активированный полимер получали сополимеризацией ДЭАА с АФИ, а иммобилизацию овомукоида осуществляли по схеме
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Сополимеризацию ДЭАА с АФИ проводили в ДМФА при 80°С, используя ДАК в качестве инициатора. Сополимеры выделяли после испарения ДМФА переосаждением в системе ацетон-гек-сан. Состав сополимера определяли из данных элементного анализа. Для иммобилизации овомукоида в раствор сополимера в 0.1 М трис-НС1 буфере (рН 8.0) вводили раствор овомукоида и перемешивали 6 ч при комнатной температуре. Продукты отделяли от исходных веществ гель-фильтрацией на Сефарозе 4В.
ММ продуктов оценивали методом упругого светорассеяния на приборе "Ма^егп-4400" (Великобритания) с 64-канальным коррелятором К7025 в диапазоне углов рассеяния 20°-90°. Образцы обеспыливали пропусканием через мембранные фильтры '^трог" (Чехия) с размером пор 0.17 мкм.
Хроматографические исследования проводили на системе "Shimadzu" с использованием колонки Symmetгy300 С18 и УФ-детектора (длина волны 280 нм).
Значения НКТС измеряли по помутнению 1%-ных растворов сополимеров при 500 нм (скорость нагревания и охлаждения составляла 1 град/мин).
Биологическую активность овомукоида определяли по подавлению им амидазной активности трипсина, используя в качестве субстрата я-нит-роанилид^-а-бензоил-0,Ь-аргинина [5].
-[сн2-сн-
-сы-сн2-]-
со
I
N / \
сн2 сн2
I 2 I 2
сн3 сн3
со
I
0
1
N
ос со
+ овомукоид
Аи,
^сн2-
сн
I
со
N / \
сн2 сн2 I 2 I 2 сн3 сн3
-сн-
I
со
I
ын
-сн2^
овомукоид
Изучение зависимости состава сополимеров от состава исходной мономерной смеси показало, что в использованном интервале исходных концентраций сомономеров (1-5 мол. % АФИ) состав сополимера практически не отличается от состава мономерной смеси. Рассчитанные значения констант сополимеризации для пары ДЭАА (Мх)-АФИ (М2) равны г1 = 0.69 ± 0.16, г2 = 0.57 ± 0.12. Синтезированные носители представляли собой линейные структуры с М = (2.5 до 25.0) х 104, в которых мольное содержание АФИ варьировалось от 0.9 до 5.2 мол. %.
На рис. 1 приведены температурные зависимости оптической плотности раствора гомополиме-ра ДЭАА, а также растворов сополимеров ДЭАА и АФИ. Условно кривые можно разбить на два участка. Первый характеризуется незначительными изменениями оптической плотности раствора при постепенном увеличении температуры; рост температуры способствует накоплению со-
30 35 40
т, °с
Рис. 1. Температурная зависимость оптической плотности растворов гомополимера ДЭАА (1) и его сополимеров, содержащих 0.9 (2), 3.0 (3) и 5.2 мол. % АФИ (4).
ответствующих структурных зародышей, не нарушающему при этом фазового равновесия. Постепенное накопление конформационных структур при достижении определенной критической температуры приводит к фазовому расслоению -второй участок кривой, характеризующийся значительным увеличением оптической плотности раствора при незначительном повышении температуры. Наличие такого кооперативного перехода при температурах вблизи НКТС наблюдалось также для сополимеров ^изопропилакриламида с ^метакрилоил-£-лейцином при изучении их спектров кругового дихроизма [6].
Значения НКТС синтезированных сополимеров, как и следовало ожидать, уменьшаются как с увеличением ММ сополимеров, так и с повышением содержания звеньев более гидрофобного сомономера - АФИ (табл. 1).
Иммобилизацию овомукоида проводили путем смешивания водных растворов сополимера и белка при комнатной температуре. Протекание реакции контролировали с использованием методов высокоэффективной хроматографии и светорассеяния. На рис. 2 представлены хроматограм-мы растворов белка, исходного сополимера и продуктов их взаимодействия.
На хроматограмме четко виден характерный для индивидуальных белков пик, который в процессе реакции с сополимером теряет свою остроту и приобретает более размытый присущий полиме-
1
VR, мл
Рис. 2. Кривые ГПХ раствора овомукоида (1), сополимера ДЭАА, содержащего 3 мол. % АФИ (М = 3.0 х 104) (2), и продукта их взаимодействия (соотношение сополимер : овомукоид = 1 : 1) (3).
рам вид. При этом следует отметить, что сами продукты взаимодействия белков с сополимером благодаря своей полимерной составляющей характеризуются широким молекулярно-массовым распределением.
Исчезновение пика исходного белка в продуктах реакции указывает на то, что весь введенный в реакцию овомукоид взаимодействует с сополимером. Это подтверждают также результаты изучения синтезированных производных овомукоида методом упругого светорассеяния при температуре ниже НКТС (табл. 2). Видно, что повышение содержания овомукоида в исходной смеси приводит к пропорциональному росту ММ продукта реакции.
Зависимость измеряемой ММ продукта реакции от температуры, представленная на рис. 3, показывает, что при увеличении температуры на начальном этапе ММ не изменяется. Затем при
Таблица 1. Зависимость значения НКТС сополимеров от доли звеньев АФИ в сополимере при различных ММ
Доля АФИ в сополимере, мол. % НКТС (±0.5°С) для сополимеров с разной ММ
(2.5-3.5) х 104 (7.5-9.7) х 104 (21.0-25.0) х 104
0 34.0 33.0 30.0
0.9 ± 0.2 32.0 31.5 28.5
2.1 ± 0.3 29.5 30.0 27.5
3.0 ± 0.4 29.0 29.0 26.5
4.3 ± 0.4 28.0 28.5 26.0
5.2 ± 0.5 27.5 27.5 25.0
Таблица 2. Молекулярные характеристики полимерных производных овомукоида при температурах ниже и вблизи критической
Мольное соотношение сополимер : овомукоид в исходной смеси М х 10-4 НКТС, °С (±0.5) А*, % от исходной
ниже НКТС (±7%) вблизи НКТС (±10%)
Исходный сополимер 8.5 80.0 29.0 -
1 : 1 12.0 75.0 36.0 56
1 : 2 15.5 61.0 39.5 72
1 : 3 20.0 39.0 41.0 86
* Антитриптическая активность овомукоида.
незначительном повышении температуры происходит лавинообразный рост ММ, что обусловлено увеличением вероятности взаимодействия макромолекул полученных производных овомукоида между собой с их дальнейшей ассоциацией (рис. 3).
Как показывают данные табл. 2, с увеличением содержания овомукоида в системе разница ММ производных овомукоида при температурах ниже и вблизи НКТС (степень ассоциации) уменьшается.
Зависимость НКТС синтезированных производных овомукоида и антитриптической активности иммобилизованного овомукоида от состава
Т, °С
Рис. 3. Температурная зависимость ММ сополимера овомукоида и ДЭАА-АФИ (при мольном соотношении сополимер : овомукоид = 1 : 1).
этих производных носит тот же характер, что и для описанных ранее сополимеров ненасыщенного производного овомукоида и ДЭАА [7]. Иммобилизация объемистой макромолекулы белка увеличивает гидрофильность исходного сополимера, повышая тем самым его НКТС. И чем больше макромолекул белка связано с полимерной цепочкой, тем меньше влияние самой полимерной цепи на растворимость и тем выше значения НКТС. Иммобилизация более трех молекул овомукоида на одной макромолекуле носителя приводит к образованию производного, не имеющего НКТС и полностью растворимого в воде в широком интервале температур.
Ингибиторная активность иммобилизованного овомукоида уменьшается с увеличением доли синтетического носителя и основной причиной этого, скорее всего, являются стерические препятствия, создаваемые синтетической макромолекулой для взаимодействия овомукоида с достаточно высокомолекулярным трипсином (М = = 24.5 х 103). То же относится и к активности углеводной части овомукоида, которую оценивали путем измерения константы взаимодействия овомукоида с конканавалином А (Кон А) (М = 10.2 х х 105). Значение этой константы составляет (2.5 ± 0.5) х 103, (2.2 ± 0.5) х 103, (1.8 ± 0.5) х 103 и (1.2 ± 0.5) х 103 л/моль для нативного овомукоида и овомукоида, иммобилизованного на сополимере ДЭАА-АФИ при соотношении сополимер : овомукоид = 1 : 3, 1 : 2 и 1 : 1 соответственно.
Поскольку синтезированные полимерные системы предполагается использовать в биологически активных средах живого организма, необходимо было выяснить влияние некоторых компонентов данных сред на значение НКТС. В качестве таких компонентов были использованы не взаи-
модействующие с иммобилизованным овомукои-дом соединения (№С1 и сывороточный альбумин, СА); соединения, которые образуют достаточно прочные комплексы с углеводной частью овому-
коида (Кон А) или его белковым компонентом (трипсин), а также плазма крови человека. Ниже приведены значения НКТС для мольного соотношения сополимер : овомукоид = 1 : 1:
Раствор Вода
(концентрация, мг/мл) -
НКТС, °С (±0.5) 36.0
NaCl
(10) 34.5
СА
(10) 34.5
Кон А
(5) 38.0
Трипсин
(1.5) 37.5
Плазма
38.0
Видно, что связывание молекулы иммобилизованного овомукоида в комплекс с белками повышает гидрофильность полимерного производного, что и приводит к некоторому увеличению значений НКТС. В то же время растворение в воде не взаимодействующих с овомукоидом соединений, напротив, понижает значение НКТС. Понижение НКТС при добавлении NaCl наблюдали также в работе [8] для сополимеров на основе N-изопропилакриламида. Эти эффекты хотя невелики по абсолютному значению, однако их необходимо учитывать при возможном практическом применении синтезированных систем.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Валуев Л.И., Зефирова ОН, Обыденнова И.В, Платэ НА. // Высокомолек. соед. А. 1993. Т. 3
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.