ПОВЕРХНОСТЬ. РЕНТГЕНОВСКИЕ, СННХРОТРОННЫЕ И НЕЙТРОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ, 2009, < 5, с. 55-62
УДК 539.171.4:532.74+547.979.733:616-006
СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ФЕРРОЖИДКОСТЕЙ С ПОРФИРИНАМИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ
© 2009 г. Ю. В. Кульвелис1, В. А. Трунов1, В. Т. Лебедев1, Д. Н. Орлова1, М. Л. Гельфонд2
петербургский институт ядерной физики имени Б.П. Константинова РАН, Гатчина, Россия 2НИИ онкологии имени Н.Н. Петрова, Санкт-Петербург, Россия Поступила в редакцию 27.02.2008 г.
Впервые синтезированы и исследованы методами малоуглового рассеяния нейтронов и спектрофотомет-рии комплексы наночасгиц магнетита в водной среде с порфиринами - сульфированным тетрафенилпор-фином дигидрохлоридом (И2ТРР84(ИС1)2) и препаратом "фотодитазин", использующимся в фотодинамической терапии (ФДТ) при лечении онкологических заболеваний. Также исследовано влияние биосовместимого полимера плюроника на функциональные свойства синтезированных комплексов. Полученные комплексы феррожидкости с фотодитазином и плюроником показали высокую эффективность при воздействии на культуры опухолевых клеток. Результаты могут быть использованы при создании магнито-управляемого препарата для ФДТ.
ВВЕДЕНИЕ
Фармакологические свойства порфиринов активно изучаются в течение нескольких десятилетий, поскольку многие из них родственны по химическому строению или являются синтетическими аналогами биологических молекул, таких как гемин, входящий в состав гемоглобина, и хлорофилл. Одной из важнейших областей применения порфиринов и их аналогов является фотодинамическая терапия (ФДТ) онкологических образований.
Фотодитазин - один из наиболее эффективных отечественных препаратов в ФДТ, разработанный в 1998 году на основе глюкаминовой соли хлорина е6. Он применяется в качестве фотосенсибилизатора для лечения ряда опухолей (рак кожи, рак щитовидной железы, злокачественные опухоли головного мозга и др.) [1]. Терапия основана на селективной способности фотодитазина накапливаться в онкологическом образовании с существенно более высокой концентрацией по сравнению со здоровой тканью и кровью, а также способностью фотодитазина под действием оптического облучения генерировать синглетный кислород, вызывающий гибель клеток. Поскольку концентрация фотодитазина существенно выше вблизи злокачественных клеток, то преимущественно погибают злокачественные клетки. Именно таким простым образом формулируется схема лечения, но на практике остается много нерешенных проблем, в основном связанных с недостаточным контрастом накопления рабочего препарата злокачественном онкологическом новообразовании. Актуальным является вопрос повышения контраста "злокачественное образование/здоровая ткань" для лечебного препарата.
Для этих целей в данной работе впервые исссле-довалась возможность направленной (внешним магнитным полем) транспортировки и локализации фотодитазина, связанного с частичками ферромагнитной жидкости (ФМЖ), вблизи злокачественного образования. В связи с этим разработан ряд магнитных жидкостей на водной основе с использованием фотодитазина.
Методом малоуглового рассеяния нейтронов исследовались различные способы локализации фотодитазина на частицах феррожидкости, его оптические свойства и способы их модификации. Для повышения эффективности и биологической совместимости препарата (фотодитазина) в феррожидкости вводили третий компонент - плюро-ник F-108 (тройной блок-сополимер этиленокси-да и пропил еноксида), широко используемый в фармацевтике и медицине и способный солюби-лизировать фотодитазин [2]. Плюроники облегчают проникновение лекарств через биологические барьеры, увеличивают накопление лекарств в опухолевых клетках. Авторы работы [2] обнаружили, что в системах, моделирующих процесс ФДТ, фотокаталитическую активность можно модулировать при использовании ряда плюрони-ков. Также был предложен способ увеличения фотоиндуцируемой токсичности фотодитазина в сеансах фототерапии in vitro, который заключается в одновременном добавлении фотодитазина в заведомо нетоксичных концентрациях к опухолевым клеткам [2]. Эффективность приготовленных препаратов проверялась на онкологических клеточных культурах.
Таблица 1. Синтез образцов ФМЖ
Образец Условия стабилизации магнетита Концентрация магнетита, г/дл рН
ФМЖ-1 в H2O 25 г магнетита + 37 мл 2 М HCl, 100°C [4, 5] 25.5 1.7
ФМЖ-2.1 в H2O 2 г магнетита + 150 мл 0.1 М лимонной кислоты C3H4(OH)(CO2H)3 ■ H2O и 50 мл 0.2 М гидрофосфата натрия Na2HPO4 ■ 12H2O [6] 1.0 5.3-6.5
ФМЖ-2.2 в H2O 2 г магнетита + 75 мл 0.2 М лимонной кислоты C3H4(OH)(CO2H)3 ■ H2O и 25 мл 0.4 М гидрофосфата натрия Na2HPO4 ■ 12H2O, частичное выпаривание воды при 30-40°С для увеличения концентрата магнетита 5.9 5.7-6.1
ФМЖ-2.2 в D2O 2 г магнетита + 75 мл 0.2 М лимонной кислоты C3H4(OH)(CO2H)3 ■ H2O и 25 мл 0.4 М гидрофосфата натрия Na2HPO4 ■ 12H2O 3.1 pD 5.7-6.1
ОБРАЗЦЫ
Магнетит получали из солей железа II и Ш по методике [3]. Использовали два метода стабилизации ФМЖ (табл. 1).
ФМЖ-1: активирование магнетита производили по Массару [4, 5] добавлением 2М соляной кислоты и нагреванием до 100°С. При 100°С в присутствии НС1 в поверхностные слои кристаллов магнетита внедряются ионы С1-, что обусловливает образование дислокаций. В результате этого на поверхности и в глубине кристаллической решетки феррита происходит накопление различных дефектов, и образуется активированный феррит [4]. Для очистки и выделения полученного золя его центрифугировали и пептизировали в дистиллированной воде.
ФМЖ-2: магнетит стабилизировали добавлением лимонной кислоты и фосфата натрия в соответствии с [6]. В результате адсорбции ионов лимонной кислоты на поверхности ферритов образовался устойчивый золь черного цвета, имеющий рН 5.3-5.7. Добавлением фосфата натрия получали стабильные золи с необходимым для биоприменения значением рН 6.0-6.5 [6]. Полученные растворы (ФМЖ-2.1) имели слабые магнитные свойства и низкую интенсивность рассеяния нейтронов вследствие низкой концентрации магнетита. Для повышения концентрации магнитной жидкости образец, доведенный до рН 6.5 добавлением 0.2 М раствора №2НР04 ■ 12Н20, был упарен досуха при нагревании до 70°С и растворен в воде объемом, в несколько раз меньшем объема исходного раствора. Полученная жидкость имела высокую концентрацию магнетита (4 г/дл) и сохраняла стабильность (отсутствие заметной седиментации магнитной фазы) в течение длительного времени наблюдения (более полугода).
Синтез ФМЖ-2 с большей концентрацией магнетита провели, добавляя к магнетиту то же количество лимонной кислоты и гидрофосфата натрия, растворенное в два раза меньшем объеме воды, и частично выпаривая воду из полученного образца при нагревании до 30-40°С. Полученная жидкость (ФМЖ-2.2) имела значение pH 5.7, которое доводили до 6.1 добавлением кристаллов соли Na2HPO4 ■
■ 12H2O. Подобным же образом, но без нагревания, была приготовлена ФМЖ на тяжелой воде (D2O) для проведения нейтронных экспериментов с использованием изотопного контрастирования полимерной оболочки частиц ФМЖ по отношению к водной среде, поскольку оболочка состояла из про-тонированного плюроника, имеющего слабый контраст по отношению к легкой воде. Величину pD феррожидкости, приготовленной на тяжелой воде, определенную из измеренного значения pH по формуле pD = pH + 0.4 [7] и имевшую значение 5.75, доводили до 6.1 добавлением кристаллов Na2HPO4 ■
■ 12H2O.
Как показано ниже, структура ФМЖ-2.1 (синтезированной с исходной низкой концентрацией магнетита) существенно отличается от ФМЖ-2.2 (с исходной высокой концентрацией). Концентрацию магнетита в исходных образцах определяли по массе сухого остатка, получившегося в результате прокаливания раствора известного объема.
Препарат "фотодитазин" (рис. 1) использовали в виде раствора в водной среде с концентрацией 0.5 г/дл, производства ООО "Вета-Гранд".
Сульфированный тетрафенилпорфин дигидро-хлорид (H2TPPS4(HCl)2), использовавшийся в качестве модели фотодитазина, получен от Porphyrin Products (Logan, USA).
Для исследований был выбран плюроник F-108 (молекулярная масса 14600) производства фирмы
BASF. Буква "F" в названии плюроника указывает на его исходное агрегатное состояние (Flakes, хлопья); последующие две цифры в названии указывают количество звеньев гидрофобного блока пропи-леноксидного полимера, деленное на пять; третья цифра - процентное (по массе) содержание эти-леноксида в молекуле, деленное на десять [8].
Приготовление комплексов производили смешиванием раствора H2TPPS4(HCl)2 или фотодита-зина с ФМЖ. Для ФМЖ-1 смесь нагревалась до 50-70°С и обрабатывалась ультразвуком для растворения осадка. В случае ФМЖ-2 нагревания и ультразвуковой обработки не требовалось. Образцы, содержащие плюроник, готовили добавлением к ФМЖ сначала плюроника, а затем, если требовалось, фотодитазина. Содержание тяжелой воды в растворителе для ФМЖ-2.2 при добавлении легководного раствора фотодитазина составляло 90 об. %, поэтому и остальные образцы ФМЖ-2.2 на тяжелой воде для нейтронного рассеяния доводили до 90% D2O добавлением легкой воды. Состав иссследованных растворов приводится в табл. 2-6.
МЕТОДИКА
Кривые малоуглового рассеяния нейтронов, измерялись на дифрактометре "Мембрана-2" (ПИЯФ РАН) с длиной волны А = 0.3 нм, ДА/А = 0.3,
4 я . Ö
в диапазоне переданных импульсов q = -т-sm- =
А 2
= 0.03-0.8 нм-1 (0 - угол рассеяния нейтронов) [9].
Электронные спектры поглощения растворов в видимом диапазоне регистрировали на двухлучевом спектрофотометре Hitachi U-3310.
Опыты на культурах клеток проводили в НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова Росздрава с использованием лазера "Аткус-2" с длиной волны 662 нм, применяемого для проведения ФДТ с фото-дитазином.
pH растворов определяли с помощью иономера ЭВ-74 с измерительным стеклянным электродом ЭСЛ-43-07 и вспомогательным хлорсеребряным электродом ЭВЛ-1М3.1.
I, отн. ед.
10
10
10
q, нм
Рис.1. Кривые рассеяния нейтронов на образцах ФМЖ-1 + Н2ТРР84(НС1)2 в воде, Т = 20°С: 1,3 - ФМЖ-1 без Н2ТРР84(НС1)2; 2, 4 - ФМЖ-1 + Н2ТРР84(НС1)2. Концентрации см. в табл. 1.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
М
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.