МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 5, с. 519-524
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.21.05
СИНТЕЗ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ L-ЛАКТАТОКСИДАЗЫ
у дрожжей шяяотл ыюгтсл
© 2014 г. А. Ю. Аринбасарова, Е. Н. Бирюкова, Н. Е. Сузина, А. Г. Меденцев
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук
Поступила в редакцию 12.12.2013 г.
Изучены условия синтеза Ь-лактатоксидазы дрожжами Уагтота Нро1уНса. Показано, что синтез фермента происходит в процессе роста на Ь-лактате (в экспоненциальной фазе роста). Показано также, что Ь-лактатоксидаза может синтезироваться дрожжами при росте на глюкозе, но после адаптации к стрессовым условиям (окислительный или тепловой стрессы) или в стационарной фазе роста (при исчерпании глюкозы). Для клеток, растущих на Ь-лактате, показан высокий уровень антиоксидант-ных ферментов (каталазы, супероксидисмутазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутатионредук-тазы), превышающий таковой у клеток, растущих на глюкозе. Показано также, что ультраструктура клеток, растущих на Ь-лактате, аналогична ультраструктуре клеток, растущих на глюкозе и адаптированных к различным стрессовым условиям: отмечено увеличение размеров митохондрий, повышение численности и размеров пероксисом, появление липидных и полифосфатных гранул. С целью определения внутриклеточной локализации Ь-лактатоксидазы клетки были разрушены с применением комплекса литических ферментов желудочного сока виноградной улитки. После центрифугирования гомогената в градиенте перкола были получены очищенные фракции нативных митохондрий и пе-роксисом. Показано, что Ь-лактатоксидаза локализована в пероксисомах.
Ключевые слова: дрожжи, Уагтота Нро1уНса, стресс, антиоксидантные ферменты, Ь-лактатоксидаза, локализация, митохондрии, пероксисомы.
DOI: 10.7868/S0026365614050048
L-Лактатоксидаза (КФ 1.1.3.15) — флавиновый фермент, катализирующий окисление L-лактата до пирувата с восстановлением кислорода до перекиси водорода. Среди микроорганизмов, фермент обнаружен у бактерий Aerococcus viridans [1], Streptococcus faecalis [2], Pediococcus sp. [3], Lactococus lactis [4], а также у грибов Geotricum candidum [5] и Yarrowia lipolytica [6].
Лактатоксидаза широко применяется в различных сферах: в медицине, пищевой промышленности и др. Так, фермент используется для определения содержания лактата в физиологических жидкостях человека (в крови, цереброспинальной жидкости и др.) при различных патологических состояниях. Уровень молочной кислоты служит важным клинико-диагностическим показателем гипоксии, лактоацидоза, шокового состояния, острого инфаркта миокарда и других заболеваний, связанных с неадекватным поступлением кислорода в ткани.
Мониторинг уровня этого метаболита в крови или поте спортсменов является важным средством контроля над тренировочным процессом и используется для оценки эффективности соот-
1 Автор для корреспонденции (biryukovae05@rambler.ru).
ветствующих тренажеров и тренировочных режимов [7].
Содержание лактата является также важным показателем при производстве вина, молочных и мясных продуктов. На основе лактатоксидазы созданы биосенсоры [8], используемые в медицине, виноделии и производстве продуктов питания.
Ранее было показано, что в клетках дрожжей У. Ыро1уИса Ь-лактатоксидаза появляется в процессе роста на Ь-лактате в качестве единственного источника углерода и энергии [6]. При росте дрожжей на Ь-лактате первичная реакция его окисления сопряжена с образованием токсичного для клеток пероксида водорода. Следовательно, должен существовать механизм, согласно которому образующаяся перекись водорода должна быть как-то обезврежена. Например, она может разлагаться каталазой, локализованной в перок-сисомах, а количество пероксисом и содержание в них ферментов может варьировать в зависимости от внешних условий [9].
Цель настоящего исследования — изучение условий синтеза и субклеточной локализации Ь-лакта-токсидазы у дрожжей У. Ыро1уИса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили дрожжи У. ¡1-роУНеа В КМ У-2378, полученные из ВКМ ИБФМ РАН.
Культивирование осуществляли при 29°С в колбах объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды Ридер [10] с глюкозой (1%) или Ь-лактатом (2%) на качалке (200 об/мин). Рост дрожжей оценивали по оптической плотности (к = 540 нм). Клетки из экспоненциальной или стационарной фаз роста дважды промывали стерильной дистиллированной водой и суспендировали в 50 мМ трис-фосфатном буфере, рН 7.2.
Дрожжи, растущие на глюкозе, были адаптированы к стрессовым условиям путем воздействия на них нелетальных доз оксидантов или "тепловой закалки" [10, 11]. Для этого клетки из экспоненциальной (10—12 ч) фазы роста инкубировали в среде роста в течение 60 мин в присутствии 0.5 мМ Н2О2 (при 22°С) (окислительный стресс) или при 37°С (тепловой шок).
Для определения локализации Ь-лактатокси-дазы были получены протопласты дрожжей, растущих на Ь-лактате. Для этого клетки промывали 0.9% №С1 и суспендировали в среде, содержащей 0.9 М сахарозы, 25 мМ трис-фосфатного буфера (рН 7.2), 0.5 мМ ЭДТА (средаА) и лиофилизован-ный желудочный сок улитки из расчета 0.5 г/10 г сырых клеток [12]. Лиофилизованный желудочный сок улитки предварительно очищали на колонке с сефадексом G-25 для удаления ионов тяжелых металлов. Клетки (100—150 мл суспензии) инкубировали с желудочным соком улитки (60— 90 мин) в колбах (750 мл) на качалке (200 об/мин) до образования 80—90% протопластов. Полученные протопласты промывали трижды средой А с центрифугированием при 7000 g в течение 20 мин, а затем разрушали в гомогенизаторе Поттера в среде, содержащей 0.5 М маннита, 25 мМ трис-фос-фатного буфера (рН 7.2), 0.5 мМ ЭДТА (среда Б). Неразрушенные протопласты и ядра осаждали центрифугированием последовательно при 1000 и 2000 g 15 мин. Из надосадочной фракции осаждали митохондрии центрифугированием при 5000 g в течение 15 мин. Осадок, содержащий, в основном, тяжелые митохондрии, суспендировали в среде Б (20 мл). Затем надосадочную фракцию центрифугировали при 7000 g 15 мин для удаления легких митохондрий. Осадок отбрасывали, а супернатант центрифугировали при 20000 g 20 мин. Полученный осадок, содержащий, в основном, пероксисомы и примесь мелких митохондрий, суспендировали в среде Б с маннитом (20 мл). Надосадочную жидкость центрифугировали при 100000 g 60 мин. В результате в осадке получали цитозольную фракцию и фракцию легких мембран.
Фракции митохондрий и микросом суспендировали в среде Б (180 мл), содержащей перкол в концентрации 30%. Суспензию затем центрифугировали при 30000 g 30 мин (4°C) в пробирках объемом 40 мл в вертикальном роторе Vti-50 (Beckman L5-75). Профиль градиента определяли по распределению окрашенных маркерных гранул известной плотности. Для этого со дна центрифужных пробирок отбирали аликвоты (3 мл), используя прибор Recovery system ("Beckman").
Для получения бесклеточных экстрактов клетки дважды промывали дистиллированной водой и суспендировали в 50 мМ трис-фосфатном буфере (рН 7.0), содержащем 0.5 мМ фенилметил-сульфонилфторида — ингибитора протеаз, после чего разрушали на прессе Френча. Гомогенат центрифугировали при 105000 g 60 мин. Осадок отбрасывали, а супернатант использовали для определения активности антиоксидантных ферментов и лактатоксидазы.
Активность каталазы определяли по изменению поглощения Н2О2 спектрофотометрически (Е240 = 0.32 мМ-1 см-1) [13].
Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по ингибированию восстановления 10 мкМ цитохрома с в присутствии 0.5 мМ ксан-тина и 0.5 Е ксантиноксидазы (к = 550 нм) [14]. За единицу активности принимали количество фермента, вызывающее 50% ингибирование скорости восстановления цитохрома с.
Активность изоцитратлиазы и глюкозо-6-фос-фатдегидрогеназы определяли по методу Диксона и Корнберга [15].
Активность глутатионредуктазы измеряли по убыли НАДФН в присутствии окисленного глута-тиона (Е340 = 6.22 мМ-1 см-1) [16].
Концентрацию цитохромов а + а3 определяли по дифференциальным спектрам поглощения (Е605 = 14 мМ-1 см-1) [17].
Цитохромоксидазную активность определяли по скорости окисления восстановленного цитохрома с (к = 550 нм) [17].
Лактатоксидазную активность растворимой фракции регистрировали спектрофотометриче-ски по скорости образования перекиси водорода в 20 мМ трис-фосфатном буфере (рН 8.0) в присутствии о-дианизидина (0.2 мМ), пероксидазы (5 мкг/мл) и L-лактата (2 мМ) (E436 = 8.3 мМ-1 см-1) [18].
Лактатоксидазную активность мембранной фракции, гомогената, а также целых клеток определяли по скорости потребления кислорода с помощью закрытого тефлоновой пленкой платинового электрода типа Кларка в присутствии 5 мМ L-лактата (нмоль О2 мин-1 мг-1 сухих клеток или мкмоль О2 мин-1 мг-1 белка).
Таблица 1. Условия синтеза L-лактатоксидазы дрожжами Yarrowia lipolytica
Субстрат, фаза роста Глюкоза, экспоненциальная Глюкоза, стационарная Глюкоза, экспоненциальная, окислительный стресс, (Н2О2) Глюкоза, экспоненциальная, тепловой стресс, (37°C) L-лактат
Ь-лактат-оксидазная активность, нмоль О2 мин-1 мг-1 сухих клеток 0 20.1 ± 1.4 35.4 ± 2.0 25.2 ± 1.4 120.0 ± 10.2
Таблица 2. Активности L-лактатоксидазы и антиоксидантных ферментов (мкмоль мин 1 мг 1 белка) у дрожжей Yarrowia lipolytica
Условия L-лактатоксидаза Каталаза Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа Супероксид-дисмутаза Глутатионредуктаза
Экспоненциальная фаза роста на лактате 40.2 ± 3.2 185.0 ± 11.0 148.0 ± 8.6 18.5 ± 0.6 76.3 ± 7.6
Экспоненциальная фаза роста на глюкозе 0 28.0 ± 1.3 73.0 ± 2.3 4.2 ± 0.5 24.0 ± 2.6
Содержание белка определяли с использованием биуретового реактива.
Ультраструктуру клеток изучали по методу Рейнольдса [19]. Ультратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе JEM-100B ("JEOL", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ [20].
В работе использовали Н2О2 (3%) ("Биосинтез", Санкт-Петербург); цитохром с, ксантин, ксантиноксидазу, фенилметилсульфонилфторид ("ICN"); L-лактат, маннит, ЭДТА, о-дианизидин, пероксидазу ("Sigma").
Представленные данные отражают усредненные величины результатов трех повторностей в трех сериях экспериментов при расчете стандартных о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.