БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, ¡995, том 21, № 7, с. 539 - 544
УДК 577.113.3
СИНТЕЗ И НЕКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФОСФОНИЛЬНЫХ АЦИКЛИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ 2 -ДЕЗОКСИАДЕНОЗИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ
© 1995 г. Д. В. Малахов, Д. Г. Семизаров, М. В. Ясько
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 117984, Москва, ул. Вавилова, 32
Поступила в редакцию 09.12.93 г. После доработки 26.10.94 г.
Осуществлен синтез 9-[2-(фосфонометилкарбониламино)этил]аденина, его изомера - 9-[(2-фосфо-ноэтил)аминокарбонилметил]аденина и 9-[2-[(2-фосфоноэтил)карбониламино]этил]аденина и их дифосфатов, Показано, что все три дифосфата включаются в 3'-конец цепи ДНК при катализе синтеза обратной транскриптазой вируса миелоблнстоза птиц, но не являются субстратами ДНК поли-мераз а из плаценты человека и р из тимуса теленка, а также концевой дезоксинуклеотидилтранс-феразы из тимуса теленка.
Ключевые слова: нуклеозиды; нуклеотиды, аналоги.
Среди различных фосфонильных ациклических аналогов нуклеотидов наиболее известны в качестве антиретровирусных агентов фосфоио-мётоксильные производные, например 9-(2-фос-фонометоксиэтил)аденин [1, 2]. Известны также фосфоноалкильные и фосфонометоксильные аналоги ациклогуанозина, обладающие активностью против вируса герпеса [3, 41. В недавно опубликованной работе [5] отмечается антигерпесная и антиретровирусная активность некоторых ациклических фосфонильных аналогов, содержащих двойную связь в ос-положении к атому фосфора.
Также сообщалось о способности трифосфата 9-(гидроксиэггиламинокарбонилметил)аденина проявлять свойства терминаторного субстрата ДНК-полимераз [6], однако соответствующий нуклеозидный аналог и его гомологи не обладали цитотоксичностью и антивирусной активностью в культурах клеток [7], По-видимому, такие ациклические аналоги нуклеозидов не превращаются в клетке в соответствующие трифосфаты.
Нами были синтезированы три ациклических фосфонильных аналога, имитирующих нуклео-зидмонофосфат, а также их днфосфаты. Изучена способность последних проявлять свойства тер-
Сокращсния: СВ1 - М,1\'-карбонилдиимидазол, ОТ - обратная транскриптаза, ВИЧ - вирус иммунодефицита человека, ВМП - вирус миелобластоза птиц, ТсГГ - терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза.
минаторных субстратов по отношению к различным ДНК-пол имеразам.
О II
нар2ор-сн2
он ни
(1а)
.О
А<]е
О II
н:ар2ор-сн2 он
О' (16)
Ада
Д )
3 n1-1—/
О
н3обр2ор-сн2^
он нм
о
Ас1е
(И)
О
нар20р-0-он
Оиа
-О
(Ш)
Структура двух синтезированных соединений (1а) и (И) моделирует ациклогуанозинтрифосфат (III) - активную внутриклеточную форму ациклогуанозина (ацикловира), но в то же время ациклический компонент в них содержит элементы жесткости за счет амидной группы. Некоторые
нуклеозид-5'-трифосфаты, содержащие в молекуле "жесткий" фрагмент, являются терминатор-ными субстратами 18, 9]. Соединение (16) можно рассматривать как ациклический аналог tldATP. Выбор в качестве гетероциклического основания аденина был обусловлен как соображениями удобства химического синтеза, так и сообщением А. Бапафа и соавт. [10], в котором указывается, что ациклоаденозинтрифосфат может проявлять бол ьший ингибирующий эффект, чем ациклогуа-нозинтрифосфат.
Синтез одной группы соединений приведен на схеме 1. Реакцией аденина с 1,2-дибромэтаном в присутствии гидрида натрия был получен 9-(2-бромэтил)аденин (IV), в котором бром был далее замещен на азидогруппу. Восстановление этой группы привело к 9-(2-аминоэтил)аденину (VI), который конденсировали с диэтилфосфоно-уксусной (Villa) или диэтилфосфонопропионовой (VIII6) кислотами при активации CDI. В результате деблокирования образовавшихся диэтиловых эфиров с использованием триметилбромсилана
были получены фосфонильные производные (1Ха) и (1X6).
Синтез второй группы соединений (схема 2) был осуществлен начиная с алкилирования аденина этиловым эфиром бромуксусной кислоты в присутствии бие(триметилсилил)амида калия; использование такого основания вместо ЫаН позволило сократить время реакции и превзойти выход, указанный в работе [7]. Образовавшийся эфир (X) далее бензоилировали по аминогруппе аденина и в условиях контролируемого щелочного гидролиза получали карбоиовую кислоту (XI), которую конденсировали с диэтил-2-аминоэтил-фосфонатом (XIV) в присутствии С01. Удаление эгильных групп действием Ме3Б1Вг и дебензоили-рование под действием водного аммиака привело к соединению (XVI).
|3,у-Дифосфаты (1а), (16) и (II) были получены с помощью активации СШ соответственно (1Ха), (1X6) и (XVI) с последующей реакцией с пирофо-сфатом по методу [II].
Структура синтезированных соединений подтверждена данными ЯМР- и масс-спектрометрии;
AdeH BtCH2CH2Ade (IV)
О
(Et0)2P(CH2)xC02Et (Vila) х = 1 (VII6) а-= 2
4
N3CH2CH2Ade -
(V)
О
- (ЕЮ)2Р(СН2),С02К (Villa) х — 1 (VIII6) х-2
NH2CH2CH2Ade (VI)
" 5, 6
О
О
(НО)2Р(СН2)х CNHCH2CH2Ade
(IXa) х = 1 (1X6) a = 2
da) " (IP)
Реагенты: 1 - NaH/DMF, ВгСН2С H2Br; 2 - NaN,/DMF; 3 - PPh3, NH3/H20; 4 - KOH/EtOH; 5 - CDF; 6 - Me3SiBr; 7 - CDI, (Bu,NH)2H2P2Ov/DMF.
Схема 1.
AdeH
О
(ЕЮ)2Р(СН2)2Вг (XII)
2, 3
О
ElOCCH2Ade
(X)
О
(EtO)2P(CH2)2N3 (XIII)
о
II
HOCCH2Ade (XI)
Bz
(EtO)2P(CH2)2NH2 (XIV)
О О
II и
(EtO)2P(CH2)2NHCCH2AdeBz
(XV)
7, 8
О О
II II 9
(HO)2P(CH2)2NHCCH2Ade —- (II)
(XVI)
Реагенты: 1 - (Me3Si)2NK/DMF, EtOOCCH2Br; 2 - BzCl/Py; 3 - KOH/EtOH; 4 - NaN3/DMF;
5 - H2/Pd/C; 6 - CDI; 7 - Mc3SiBr; 8 - NH3/H20; 9 - CDI, (Bu3NH)2H2P207/DMF.
Схема 2.
СИНТЕЗ И НИКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
541
10 20 I I
GGGTCAGTGCTGCAACATTTTG(5')
(5')32pCCCAGTCACGACGT -^
направление элонгации праймера
Рис. 1. Праймер-матричный комплекс.
их УФ-спектры соответствуют аденозиновым производным (данные не приводятся). Гомогенность веществ контролировалась с помощью ТСХ на силикагеле, а также на основании данных ЯМР-спектрометрии.
Были изучены субстратные свойства синтезированных соединений (1а), (16) и (II) по отношению к некоторым ОТ ретровирусов, ДНК-поли-меразам млекопитающих, фрагменту Кленова ДНК-полимеразы I из Е. coli и TdT из тимуса теленка. Исследования проводили в системе, содержащей 5'-32Р-меченый праймер-матричный комплекс (рис. 1), фермент и одно из исследуемых соединений или же, для контроля, природный субстрат dTTP.
Из рис. 2 (серии А и В, дорожки 3,4) видно, что соединение (16) проявило субстратные свойства по отношению к ОТ В МП и фрагменту Кленова ДНК-полимеразы I. В то же время оно не включалось в растущую цепь ДНК в реакциях удлинения праймера, катализируемых ОТ ВИЧ, ДНК-
полимеразами а из плаценты человека и Р из тимуса теленка (рис. 2, серии Б, Г, Д, дорожки 3, 4), а также TdT (данные не приведены). Соединения (Та) и (II) проявили близкие субстратные свойства, но при этом не узнавались ДНК-полимера-зой I (данные не приведены).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Диэтиловый эфир 2-бромэтилфосфоновой кислоты (XII) и триэтил-3-фосфонопропионат (VII6) были получены по методике [12], диэтилфосфо-ноуксусная кислота (Villa) - по методике [13]. Раствор бис(три-н-бутиламмоний)пирофосфата в DMF готовили по методике [14]. Использовались DEAE-целлюлоза DE-32 фирмы Whatman (в НСО3 -форме); азид натрия, 10% Pd/C, Kieselgel 60 (63 - 100 мкм) и LiChroprep RP-18 (25 - 40 мкм) фимы Merck; триметилбромсилан, 1,2-дибром-этан, 80% суспензия NaH в минеральном масле, триэтилфосфит, триэтилфосфоноацетат, аденин, трифенилфосфин, бис(триметилсилил)амид калия и CDI фирмы Fluka; дауэкс 50 WX 8 фирмы Serva; пиридин и DMF фирмы Aldrich.
'Н-ЯМР-спектры сняты на приборе Varian XL-100-15 (США) с рабочей частотой 100 МГц (внутренний стандарт - mpem-бутанол). 1 ^С-ЯМР-спектры (62.89 МГц, с подавлением расщепления на протонах, внутренний стандарт - 1,4-диоксан)
У\2\3\4 1\2\3\4 1\2\3\4 ¡\2\3\4 1\2\3\4
А Б Б Г д
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов реакции элонгации 14-членного праймера ОТ ИМИ (серия А), ОТ ВИЧ (Б), ДНК-полимеразой I, фрагмент Кленова (В), ДПК-полимеразой (3 из тимуса теленка (Г) и ДНК-полимеразой а из плаценты человека (Д). Дорожка 1 - 5'- Р-меченый праймер-матричный комплекс (контроль); 2 - то же + 5 мкМ сЛТР + + 5 мкМ <ЮТР + 5 мкМ с1АТР: 3 - то же + 5 мкМ сЛТР + <5 мкМ сЮТР + 10 мкМ (16); 4 - то же + 5 мкМ с1ТТР + 5 мкМ 11С.ТР+ 100 мкМ (16).
и 11 Р-ЯМР-спе ктры (101.27 МГц, без подавления расщепления на протонах, внешний стандарт -85% фосфорная кислота) сняты на приборе Bruker WM-250 (США). Величины КССВ (7) измерены в герцах. При описании 'Н-ЯМР-спектров приняты следующие сокращения: с - синглет, д - дублет, т - триплет, к - квартет, м - мультиплет, ус - уширенный синглет, дд - дублет дублета, дт - дублет триплета, дк - дублет квартета. Масс-спектры в режиме FAB выполнены на спектрометре Kratos MS 50ТС, образцы смешивались с глицерином. Температуры плавления были определены на приборе РНМК (Германия).
9-(2-Бромэтил)аденин (IV). К интенсивно перемешиваемой суспензии 2.7 г (20 ммоль) аденина в 60 мл DMF прибавляли 0.6 г (20 ммоль) 80% NaH. а через 1 ч приливали 4 мл (46 ммоль) 1 ;2-дибромэтана. Перемешивали 20 ч при 20°С, нейтрализовали 0.1 М HCl, упаривали. Остаток промывали гексаном и дважды перекристаллизо-вывали из воды. Выход 2.68 г (55%), т. пл. >300°С (с разд.). 'Н-ЯМР (DMSO-4,; 5, м. д., J, Гц): 8.15с (2Н, Н-2, Н-8), 7.18с (2Н, NII2), 4.55т (2Н, J 6, CH2Ade), 3 .96т (2Н, J 6, СН2Вг). Масс-спектр, m/z: 242, 244 (1 : 1) (МН+).
9-(2-Азидоэтил)аденин (V). К раствору 0.6 г (2.5 ммоль) бромида (IV) в 10 мл DMF добавляли 0.3 г (4.6 ммоль) NaN3, перемешивали 10 ч при 20°С, упаривали, остаток перекристаллизовыва-ли из воды. Выход 0.45 г (89%), т. пл. 184.5°С. 'Н-ЯМР (DMSO-d6): 8.15с (2Н, Н-2, Н-8), 7.18с (2Н, NH2), 4.31т (2Н, J 6, CH2Ade), 3.84т (2Н, J 6, CH2N,). Масс-спектр, m/z: 205 (A/I-P).
9-(2-Амипоэтил)аденин (VI). К раствору 400 мг (1.96 ммоль) азида (V) в 30 мл диоксана добавляли 790 мг (3 ммоль) трифенилфосфина, через 1 ч при 20°С обрабатывали 20 мл 25% водного аммиака. Через 2 ч упаривали, прибавляли 30 мл воды, отфильтровывали, фильтрат наносили на колонку (3x5 см) с дауэксом 50 (NHJ), элюировали 1% водным аммиаком. Фракции, содержащие соединение (VI
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.