УДК 577.175.82.05:612.112.94
СИНТЕЗ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ СВОЙСТВА МИЕЛОПЕПТИДА МП-1
© 2012 г. Л. А. Фонина*, Е. М. Трещалина***, Р. Г. Белевская*, А. А. Азьмуко**, М. А. Ефремов*, Л. А. Седакова***, Е. А. Кирилина*,#
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **НИИэкспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ ***НИИэкспериментальной терапии и диагностики опухолей РОНЦим. Н.Н. Блохина РАМН Поступила в редакцию 17.11.2011 г. Принята к печати 18.11.2011 г.
Классическими методами пептидной химии в растворе проведен синтез костномозгового пептида Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thr (МП-1) и изучены его противоопухолевые свойства. Показано, что пептид МП-1 усиливает эффективность цитостатической терапии лимфолейкоза Р388, увеличивает латентный период прививаемости лимфолейкоза Р388 у облученных мышей, а также снижает рециди-вирование аденокарциномы молочной железы (Са-755) у мышей после операции.
Ключевые слова: миелопептид МП-1, синтез, противоопухолевая активность, иммунодепрессия.
ВВЕДЕНИЕ
Гексапептид Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thr относится к группе эндогенных регуляторных пептидов (миелопептидов — МП), продуцируемых клетками костного мозга, и назван миелопепти-дом-1 (МП-1). Изучение биологической активности и механизмов действия индивидуальных миелопептидов показало, что каждый из 6 выделенных к настоящему времени пептидов направленно действует на определенный тип иммуно-компетентных клеток, реализуя свои иммуно-корригирующие эффекты по природным механизмам [1, 2].
Ранее было показано, что МП-1 является им-муномодулятором, нормализующим антителооб-разование у животных с иммунодефицитами различной этиологии, вызванных, в частности радиацией, цитостатиками или антибиотиками [3—5].
Создание у мышей направленных дефицитов in vivo путем избирательной элиминации Т- или В-клеток показало, что иммунокорригирующее действие МП-1 осуществляется через популяцию Т-клеток [4]. Изучение связывания флуоресцеин-
Сокращения: МП-1 — миелопептид-1; ЦП — цисплатин; ТРО — торможение роста опухоли; СПЖ — средняя продолжительность жизни; УПЖ — удлинение продолжительности жизни; п/к — подкожно; ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография; ОМР — ЛЛ-диметилфор-мамид.
# Автор для связи: тел.: (495) 330-72-56; эл. почта: ктИпае1еп@ yandex.ru.
меченного МП-1 с поверхностью лимфоидных клеток методом двойного флуоресцентного окрашивания позволило установить, что клеткой-мишенью данного регуляторного пептида является СЭ4+-Т-лимфоцит, т.е. Т-хелпер [6]. В основе механизма иммунокорригирующего действия МП-1 лежит его способность нормализовать нарушенный баланс СВ4/СЭ8-клеток (Т-хелперы/Т-су-прессоры), результатом чего является восстановление уровня антителообразования [7].
Поскольку ранее было показано, что МП-1 нормализует нарушенный баланс основных регу-ляторных субпопуляций клеток СВ4/СЭ8, что характерно, в том числе, для роста опухоли, представлялось интересным изучить способность этого пептида оказывать противоопухолевое действие: тормозить рост различных опухолей в условиях иммунодефицита, вызванного радиационным облучением или постоперационным стрессом.
Целью данной работы было изучение иммуно-корригирующих и противоопухолевых свойств гексапептида МП-1 в условиях иммунодефицита, индуцированного как радиацией или операционным стрессом, так и развитием злокачественных опухолей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Пептид МП-1 Рке-Ьеи-01у-РИе-Рго-ТЬг синтезировали классическими методами пептидной химии в растворе по схеме (3+3). Л- и С-Конце-
Таблица 1. Эффективность моно- и комбинированного применения МП-1 и цисплатина (ЦП) на мышах с подкожным лимфолейкозом Р-388
Препарат Доза, г/мышь ^р (мм3)& ТРО, %& СПЖ, сут УПЖ, %
Контроль - 461; 2948; 6348 - 21.1 -
МП-1 1 х 10-8 73; 1132; 2111 84*; 62*; 67* 21.5
ЦП 8 х 10-8 60; 362; 993 86*; 91*; 86* 24.7 28*
ЦП 1.6 х 10-7 39; 175; 750 91*; 94*; 88* 27.8 31*
ЦП + МП-1 8 х 10-8 + 1 х 10-8 9; 66; 367 98**; 97**; 94** 32.8 32*
ЦП + МП-1 1.6 х 10-7 + 1 х 10-8 2; 79; 335 99**; 97**; 95** 33.7 39*
& Три цифры соответствуют последовательно результату на 11-е, 14-е и 18-е сутки после перевивки опухоли. Примечание: при 10-кратном курсе МП-1 интервал между инъекциями составлял 24 ч; отличие от контроля: *р < 0.05, **р < 0.01. ^гр (мм3) — средний объем опухоли в мм3; СПЖ — средняя продолжительность жизни; УПЖ — удлинение продолжительности жизни.
вые трипептиды получали последовательным наращиванием пептидных цепей по ^-концу методом активированных ^-оксисукцинимидных эфиров. Полученные трипептиды конденсировали карбодиимидным методом. Для блокирования a-аминогрупп аминокислот использовали Boc- и Z-заместители, карбоксильные группы защищали солеобразованием, С-концевую карбоксильную группу треонина защищали амидированием. Целевой гексапептид МП-1 выделяли и очищали методом обращенно-фазовой хроматографии, он охарактеризован данными аналитической ВЭЖХ, масс-спектрометрии и секвенирования.
В первой серии экспериментов изучали влияние МП-1 на рост и развитие лимфолейкоза Р388, а также эффективность применения данного пептида в сочетанной цитостатической противоопухолевой терапии. Для оценки эффективности противоопухолевого действия МП-1 в качестве положительного контроля использовали цито-статик цисплатин (ЦП), используемый в клинической практике.
Противоопухолевую активность МП-1 и ЦП оценивали in vivo на различных типах перевиваемых мышиных опухолей (лимфолейкоз Р388, аде-нокарцинома молочной железы Са 755), полученных из банка опухолевых штаммов Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Бло-хина.
Опыты проводились на мышах с подкожно (п/к) перевитым лимфолейкозом Р-388. Цисплатин вводили однократно внутрибрюшинно в дозах 8 и 4 мг/кг, вызывающих существенную имму-нодепрессию. Лечение ЦП начинали через 24 ч после перевивки опухоли. МП-1 вводили п/к в разовой дозе 1 х 10-8 г/мышь ежедневно со 2-го по 11-й дни после перевивки опухоли. Результаты проведенных экспериментов представлены в табл. 1.
Показано, что в монотерапии МП-1 вызывал значимое торможение роста опухоли (ТРО) на
84% сразу после окончания курса лечения без существенного влияния на продолжительность жизни мышей. ЦП в монотерапии в дозах 8 х 10-8 и 1.6 х 10-7 г/мышь был практически равноэф-фективен МП-1 и вызывал максимальное ТРО, равное 86—94%, которое удерживалось в течение недели на уровне 86—88%; продолжительность жизни мышей при этом возрастала на 28—31%. В группах с комбинированной терапией при введении ЦП (в дозах 8 х 10-8 и 1.6 х 10-7 г/мышь) и МП-1 (в разовой дозе 1 х 10-8 г/мышь в течение 10 дней), к концу первой недели после отмены лечения ТРО возросло до 94—95%. Продолжительность жизни мышей в этих группах увеличилась на 32 и 39%, т.е. была практически в 1.5 раза больше, чем при монотерапии ЦП. Таким образом очевидно, что комплексная терапия лимфолей-коза Р-388 с использованием ЦП и МП-1 оказывает более выраженное действие не только на прививаемость опухоли, но и на продолжительность жизни животных в отличие от монотерапии как МП-1, так и ЦП.
Далее было изучено противоопухолевое и профилактическое действие МП-1 на рост и развитие лимфолейкоза Р-388 в условиях иммуносупрес-сии, вызванной радиационным облучением. Мышам линии ВЭР1 в течение 5 дней (с промежутком 24 ч) вводили МП-1 в диапазоне доз 1 х 10-8 —1 х х 10-5 г/мышь. Затем облучали в дозе 4.5 Гр и через 24 ч подкожно прививали 103 клеток лимфолейкоза Р-388, продолжая введение МП-1 на протяжении еще 5 дней после перевивки. Результаты экспериментов представлены в табл. 2.
Из данных таблицы видно, что в контрольной группе опухоли появлялись у мышей на 15-й день (латентный период), в экспериментальных группах № 2—4 опухоли также возникали на 15-е сутки, но у меньшего количества животных, при этом в группе 4 опухоли начали появляться еще и позже (17-й день). Десятидневное введение МП-1
Таблица 2. Влияние МП-1 на прививаемость лимфолейкоза Р-388 в условиях радиационного стресса (4.5 Гр)
Номер группы Доза МП-1, г/мышь Дни после введения Р-388 (гибель животных, %)
14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
1 (контрольная группа)* 0 60 70 90 100
2 1 х 10-5 0 44 56 67 100
3 1 х 10-6 0 40 50 70 80 90 90 90 100
4 1 х 10-7 0 30 40 50 60 90 90 90 90 100
5 1 х 10-8 0 0 0 40 40 60 60 60 70 80 100
* Введение физиологического раствора.
Таблица 3. Влияние МП-1 на спонтанное рецидивирование Са-755 молочной железы у мышей в условиях имму-нодепрессии, вызванной операционным стрессом
Введение МП-1, 1 х 10-8 г/мышь Количество мышей (всего) Количество мышей с рецидивом Рецидивирование, %
— (контрольная группа)* 34 22 65
2—11 день после операции 28 13 46
по 5 дней до и после операции 32 14 44*
* Введение физиологического раствора ежедневно в течение 10 дней. *р < 0.05.
задерживало появление опухолей до 22—24 дней. Максимальная задержка прививаемости лейкоза составила 6 дней (33—35%) при разовой дозе МП-1, равной 1 х 10-8 г/мышь, что весьма существенно с учетом короткой продолжительности жизни мышей с этой опухолью.
Полученные результаты позволяют сделать вывод, что МП-1 обладает профилактическим эффектом: его введение достоверно замедляет возникновение опухолей, продлевает срок жизни подопытных животных и снижает уровень радиационной иммуннодепрессии у мышей.
Во второй серии экспериментов исследовали противоопухолевое и профилактическое действие МП-1 на возникновение спонтанных и искусственных рецидивов опухолей в условиях им-мунодепрессии, вызванной операционным стрессом — удалением аденокарциномы молочной железы Са-755 у мышей. Известно, что послеоперационный стресс сопровождается стимуляцией метастазирования и рецидивирования опухолей. Наступление экспоненциальной фазы роста опухоли, при которой происходит резкое увеличение размеров опухоли в краткие сроки, соответствует преодолению иммунологического надзора организма, т.е. выраженной иммуноде
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.