БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 5, с. 382 - 385
УДК 577.152.313*25.042 -.547.455.62718.057
СИНТЕЗ И СВОЙСТВА ФОСФОНАТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
ГЛЮКОЗЫ И ГАЛАКТОЗЫ
© 1995 г. Н. Ш. Падгокова#, С. Афсар*, Г. Б, Ф. Диксон*, М. Я. Карпейский
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 117987, Москва, ул. Вавилова, 34 ■' Факультет биохимии Кембриджского университета, Великобритания Поступила в редакцию 24.05.94 г.
Синтезированы фосфонатные аналоги глюкота-6-фосфата и галактоза-6-фосфата: 6-дезокси-6■фос-фоно-а.р-О-глюкопиракоза и 6-дезокси-6-фосфоно-а,Р-0-галактопираноза. Показано, что полученные фосфонаты являются слабыми ингибиторами 1/,-лшо-инозит-1-фосфатазы.
Ключевые слова: 6-дезокси-6-фосфоно-а,р-0-глюкопираноза; 6-дезокси-6-фосфоно-а,р-0-галак-топираноза; ингибиторы; 1 Ь-мио-инозит-1 -фосфатаза.
Фосфонатные аналоги природных эфиров фосфорной кислоты - уникальные соединения, широко используемые как для изучения механизма действия ферментов, катализирующих различные превращения эфиров фосфорной кислоты, так и для создания на их базе эффективных биологически активных соединений, применяемых в медицине и сельском хозяйстве.
1£-лшо-Инозит-1 -фосфатаза (КФ 3.1.3.25) катализирует гидролиз двух энантиомерных субстратов. Один из них - 1Л-лшо-инозит-1 -фосфат, называемый также Ш-жмо-инозит-З-фосфат (1шЗР)
[1], соединение, которое получается из глюкоза-6-фосфата при биосинтезе инозита. Второй субстрат - Ш-лшо-инозит-1-фосфат (¡шИ5), продукт расщепления инозитсодержащих фосфолипидов
[2]. Таким образом, фермент регулирует уровень миоилозита в клетках, А так как действие некоторых терапевтических средств, используемых для лечения заболеваний центральной нервной системы, в особенности маниакальной депрессии, сопровождается повышением уровнямио-инозитфо-сфата [2], поиск новых ингибиторов лшо-инозит-1 -фосфатазы представляет большой интерес.
Известно, что многие ферменты, субстратами которых являются зфиры фосфорной кислоты, могут связываться также и с фосфонатными аналогами субстратов, в которых группа -0-Р03Н2 замещена на -СН2-Р03Н2. Легко видеть, что р-аномеры б-дезокси-б-фосфонопроизводных глюкозы (VI) и галактозы (XI) могут рассматриваться как структурные аналоги двух субстратов мио-инозит-1-фосфатазы, атом кислорода кольца в которых замещен на -СН(ОН) группу. Фосфо-натный аналог лшо-инозит-1 -фосфата синтезиро-
ван Кулаговским [3], но данные о взаимодействии этого аналога с ферментом не ипубликованы.
В настоящей работе представлен синтез фосфо-натных аналогов глюкоза-6-фосфата и галактоза-6-фосфата: 6 - д е з ок си- ф о сфоно - а, (3 -О - г л го ко п и -раноза (VI, 6й?б1с6Р) и 6-дезокси-6-фосфоно-а,|3-О-галактопираноза (XI,
В литературе известны три подхода для введения фосфонатной группировки в молекулу углевода: ферментативный [4], реакция Виттига [5 - 7] и реакция Арбузова [5,7- 11]. Синтез фосфоната (VI) описан ранее [7, 8]. В работе [7] в реакции Арбузова используется 1,2,3,4-тетра-О-бензил-6-бром-6-дезокси-(3-£>-глюкопираноза, что усложняет снятие защитных группировок и существенно снижает выход фосфоната (VI). В работе [8] авторы выбрали в качестве исходного соединения триацетат левоглкжозана, нагревание которого с РВг5 в СБ2 с последующим ацетилировани-ем приводило к бромиду (III). В настоящей работе
к
/
сн2
АсО-^Г-^О АсОД-—
ОАс
Я
Ме О
ОАс
О
Ме О
О
О
Автор для переписки.
к
(I) ОТг
(11) ОН
(III) Вг
(IV) Р(О)(ОЕ02
(V) Р(0)(0н)2
Ме АД
Ме
Я
(VII) он
(VIII) Вг
(IX) Р(О)(ОЕ02
(X) Р(0)(0Н)2
О
Р03Н2
' он
но но
он
он
1 L-Miio-Инозит-1 -фосфат
НО НО
РО;,Н2 СН,
-о
ОН
он
(VI) бйГСкбРф)
0-P03H2 сн2
он
Glc6 Р ((3)
ГО3Н2
H<¡V
V^^V-oh ноЛ^^-Л^он он
Ш-лио-Инозит-1 -фосфат
Р03Н2
Táto
он
(XI) 6<iGal6 Р (Р)
о-ю3н2 НО /н
^о он
С>а16Р((3)
предлагается использовать в качестве исходных соединений легко получающиеся производные с единственной свободной ОН-группой при С6 ((II) [12] - из глюкозы и (VII) [13] - из галактозы).
Детритилирование полностью защищенной [3-£)-глюкопиранозы (I) действием BF3 • Е^О в метаноле [14] приводило к количественному выходу соединения (II). Бромированием соединений (II) и (VTI) смесью CBr4-Ph3P в DMF [15] получали бромиды (Ш) (выход 60%) и (VIII) (выход 32%). Реакцией Арбузова, кипячением бромидов (III) и (VIII) с (EtO),P [9], синтезировали фосфонаты (IV) и (IX) с высокими выходами. В 'Н-ЯМР-спектрах полученных соединений наблюдаются сигналы протонов защитных групп, а также группы Р-СН2 в области 2 м. д. Обработкой полученных диэтилфос-фонатов (IV) и (IX) Me3SiBr в дихлорэтане [16] селективно удаляли этильные группы (выход (V) и (X) 95%). После снятия ацетильных (0.2 М MeONa в метаноле) и изопропилиденовых защит (75% АсОН) выделяли с высоким выходом фосфонаты (VI) и (XI). По данным 'Н-ЯМР-спектров этих соединений, соотношение а- и Р-аномеров в случае глюкопиранозы 1 : 2.36, в случае галактопирано-зы - I : 2.
В таблице представлены предварительные результаты по ингибированию [¿-чшо-инозит-1-фос-фатазы полученными фосфонатами. Глюкоза-6-фосфат и 6dGlc6P (VI) являются конкурентными ингибиторами, для которых значения К{ составляют 23 и 13.5 мМ соответственно (см. таблицу). Глюкоза и галактоза при концентрации 10 мМ не проявляли заметных ингибиторных свойств.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Спектры 'Н-ЯМР регистрировали на спектрометре Varían XL-100 (США) и Bruker WM-360 (ФРГ) с рабочей частотой соответственно 100 и 360 МГц при концентрации образцов около 5 х 10~2 М при 35°С. Химические сдвиги протонов (5) приведены относительно стандарта Me4Si для растворов в
СОС13, для растворов в 020 измерения проводили с внутренним стандартом т/;ет-бутиловым спиртом и пересчитывали относительно Ме43[, принимая химический сдвиг трет-бутилового спирта относительно Ме481 равным 1.27 м. д. Величины КССВ (/) измеряли в герцах. Температуры плавления определены на приборе ТП (СССР) и не исправлены. Препаративную хроматографию проводили на силикагеле Ь40-100 (ЧСФР), ТСХ - на пластинках БИиМ 1^254 (ЧСФР). Системы для ТСХ: СНС13 (А), /РЮН-Ш40Н-Н20 (7:1:2) (Б). Кристаллические соединения дают удовлетворительный элементный анализ. Выделение и очистку человеческой рекомбинантной 1 Ь-мио-шотт-1-фосфатазы проводили согласно работе [17]. Активность фермента определяли регистрацией [,4С]инозита, получающегося из lL-[U-l4C]Insl/-, (12.5 нКи на опыт) [18]. Суммарную концентрацию субстрата варьировали от 0.05 до 0.5 мМ. Влияние ингибиторов на активность фермента определяли при конечной концентрации ингибитора 10 мМ.
1,2,3,4-Тетра-0-ацетил-(1-£>-гл10копираноза (II).
К раствору 1.2 г (2 ммоль) соединения (I) [10] в
Ингибирование 1£,-лшо-инозит-1-фосфатазы аналогами субстратов*
Соединение K\ **, мМ
6¿Glc6/> (VI) 13.5
GlcóP 23.0
Glc >25.0
6¿Gal6/> (XI) ***
Gal 6P ***
Gal >25.0
* Константа Михаэлиса, Кт 0.25 мМ. ** [I] 10 мМ.
*** Согласно предварительным результатам, эти соединения проявляют лучшие ингибиторные свойства, чем соответствующие производные глюкозы.
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 21 № 5 1995
384
ПАДЮКОВА и др.
75 мл СН2С12 добавляли 0.8 мл метанола и 0.25 мл BF3 ■ Et20. Желтый раствор промывали холодной водой (3 х 20 мл), сушили Na2S04, упаривали, остаток хроматографировали на колонке с Si02 (100 г) в хлороф ме, получали продукт с количественным выходов масло, которое кристаллизуется после обработки эфиром, Rf 0.23 (А), т. пл. 128°С (лит. 128 - 129°С [12]). 'Н-ЯМР-спектр (CDC13); 5.72д (1Н, У, 2 8.2; HI); 5.31дд (1Н, У3 2 9.5; У3 4 9.5; НЗ); 5.12дд (1Н, Н2); 5.08дд (1Н, У4 5 9.5; Н4); 3.77 - 3.58м (ЗН, Н5, Нб); 2.3дд (Ш, У0н,ы 5-8; Уон. 8.2, 6-ОН, обменивайся при добавлении 0,0); 2.11с, 2.08с, 2.04с, 2.03с (4 х ЗН, 4Ас).
1,2,3(4-Тетра-0-ацетил-6-бром-6-дезокси-р-0-глюкопираноза (III). 3.1 г (9 ммоль) соединения (II) высушивали в эксикаторе над P2Os, растворяли в 40 мл DMF, к раствору добавляли 2.4 г (9 ммоль) Ph3P и 4.3 г (L2.9 ммоль) СВг4 и оставляли в темноте при комнатной температуре на 48 ч. К реакционной смеси добавляли 9.3 мл метанола, упаривали в вакууме, остаток хроматографировали па колонке с Si02 (200 г), продукт элюировали хлороформом, получали 1.8 г (60%), Rf 0.79 (А). 'Н-ЯМР-спектр (CDCI3): 5.68д (1H, У, , 8.2; HI); 5.30 - 4.90м (ЗН, Н2, НЗ, Н4); 4.84м (1Н,' Н5); 3.54 -3.21м (2Н, Н6); 2.08с, 2.02с, 1.98с, 1.96с (4 хЗН, 4Ас).
1,2,3,4-Ди-О-нзопропилиден-б-бром-б-дезокси-a-D-галактопираноза (VIII) [19, 20] была получена аналогично из 2.5 г (9.6 ммоль) соединения (VII). Выход 1 г (32.3%); Rf 0.8 (А). 'Н-ЯМР-спектр (CDC13): 5.46д (IН, 7, 25; 111); 4.57дд (Ш, У, 2 7.5; У, 4 2.5; НЗ); 4.35 - 4.21м (2Н, H2, Н4); 3.93дт (У, 4 2; 4«ц = J5 бь 7.0; H5); 3.55 - 3 23м (H2, 116); 1.52с, 1.42с, 1.33с, 1.30с (4 х ЗН, 4.М ¡.
1,2,3,4-Тетра-()-ацетил-6-дезокси-6-(диэтилф«с-фо1ш)-(3-£>-глюкопираноза (IV). Раствор 2 г (4.9 ммоЛй) бромида (III) в 16 мл (ЕЮ)3Р кипятили с воздушным холодильником и с защитой от влаги воздуха 12 ч. Реакционную смесь упаривали в. вакууме досуха, остаток растворяли в хлороформе и хроматографировали на колонке с Si02 (120 г). Продукт элюировали хлороформом. Получали 2 г (71%) продукта (IV), Rf 0.2 ( А), 0.7 (Б). 'Н-ЯМР-спектр (CDC13): 5.75д (1H ./, 2 8.2, HI); 5.21т (1Н, 2 9.5; У3 4 9.5; НЗ); 5.11д (1Н, Н2); 4.91дд (1Н, Л s 9.5; H4); 4.07м (5Н, ИЗ, ОСН2СН3); 2.09с, 2.05с, 2.03с, 2.00с (4 х ЗН, 4Ас); 2ЮЗм (2Н, Н6); 1.29т (6Н, ./chich2 7; 0СН2СН3).
1,2,3,4-Дн-0-изонропилиден-6-дсзоксн-б-(ди-этилфосфоно)-а-£>-галактопираноза (IX) получена аналогично из 700 мг (2.17 ммоль) бромида (VIII). Выход 800 мг (97%); Я, 0.14 (А); 0.78 (Б). 'Н-ЯМР-спектр (CDCi3): 5.16д (Ш, J\ г 5; HI); 4.32дд (1Н, У3 2 7.2; У3 4 2; НЗ); 4,0 - 3.68м (6Н, Н4,
Н5, ОСН2СН3); 1.8м (2Н, Нб); 1.2 - 0.9м (18Н, Ме, ОСН2СН3).
1,2,3,4-Тетра-О-ацетил-б-дезокси-б-фосфоно-Р-С-глюкопираноза (V). К раствору 1 г (2.15 ммоль) соединения (IV) в 15 мл дихлорэтана добавляли 3.2 мл Вг81Ме3 и оставляли при комнатной температуре на 12 ч. Раствор упаривали в вакууме досуха, к остатку добавляли 21 мл воды и 9 мл пиридина, через 1 ч водный раствор экстрагировали эфиром (3x5 мл), у
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.