w
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № Я, с. 580 - 586
УДК 577.152.1+577.114.012.6
СИНТЕЗ И СВОЙСТВА КОНЪЮГАТОВ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ И КАТАЛАЗЫ С ДЕКСТРАНАМИ
© 1995 г. А. Н. Еремин, Д. И. Метелица*
Институт биоорганической химии АН Белоруссии, 220141, Минск, ул. Жодинская, 5/2
Поступила н редакцию 30.06.94 г.
С целью оптимизации получения конъюгатов супероксиддисмутазы и каталазы с декстранами, активированными методом периодатного окисления, изучено влияние на каталитическую активность конъюгированных ферментов начальных соотношений [МаЮ^Ддекстран], [ферментИальдегид-декстран] и [супероксиддисмутаза!/[каталаза], а также рН и молирности буферных сред, в которых проводится конъюгирование. Показано влияние последовательности связывания ферментов с аль-дегнддекстранами в биферментных конъюгатах на каталитическую активность каждого из них. Констатировано снижение операционной устойчивости каталазы при ее конъюгировании с альде-гиддекстранами совместно с сунероксиддисмутазой. Обсуждена проблема взаимного влияния на операционную устойчивость каждого из ферментов в составе биферментных конъюгатов при их использовании в циклических биокаталитических процессах.
Ключевые слова: супероксиддисмутаза, каталаза, соиммобилизация ферментов, альдегид-декстрины, антиоксидантная система, операционная устойчивость ферментов.
Супероксиддисмутаза (КФ 1.15.1.1), каталаза (КФ 1.11, [ .6) и глутатионпероксидаза (КФ 1.11.1.9) -компоненты эффективной защитной системы организмов человека и животных от токсичных метаболитов кислорода - его активированных форм, суперокисного аниона, 02, и пероксида водорода [1-3]. Одной из важнейших задач современной инженерной энзимологии и биотехнологии является создание антиоксидантных комплексов названных ферментов для их использования в медицинской практике в двух направлениях: 1) приготовление конъюгатов ферментов с водорастворимыми биополимерами для внутреннего применения; 2) конструирование экстракорпоральных ферментных реакторов, заполненных соиммобилизованными ферментами на подходящем носителе, для очистки биологических жидкостей от токсичных агентов (02 и Н202) при ряде заболеваний и особенно при радиотерапии больных с различными формами патологий [3 - 5].
Практика показала, что наиболее подходящие носители для супероксиддисмутазы и каталазы -
Сокращения: АД 15, АД40, АД70 - альдегиддекстраны с мол. массой 15 - 20, 40 и 70 кДа соответственно; Е1 - супероксиддисмутаза; Е2 - каталаза; Е,-АД - конъюгат супер-оксиддисмутаза-альдегиддекстран; ША - этилендиамин; РЕ1 - полиэтиленимин; ОА - овальбумин; АОТ - натриевая соль ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты (Аэрозоль ОТ); буферные растворы: 50 мМ бикарбонат-ный буфер, рН 9 (А), 50 мМ фосфатный буфер, рН 8 (Б), 10 мМ ацетатный буфер, рН 4.5 (В). * Автор для переписки.
полисахариды: первый фермент конъюгирован с декстранами [6], второй иммобилизован на формованных ацетил- и фосфоцелл юлозных носителях [7], а вместе ферменты иммобилизованы на декстранах после активации последних известным методом периодатного окисления [8]. При иммобилизации ферментов очень важно сохранение ими максимально высокой активности и термостабильности [9]. В большинстве работ, выполненных до настоящего времени, мало внимания уделяется операционной устойчивости ферментных препаратов, т.е. их стабильности в ходе каталитического процесса в реальных условиях использования. Фактор операционной устойчивости особенно важен для окислительно-восстановительных ферментов.
Активность и стабильность ферментов анти-оксидантной системы взаимозависимы [2]: супер-окисный анион подавляет активность каталазы и глутатионпероксидазы [2, 10], пероксид водорода вызывает фрагментацию супероксиддисмутазы Г11 ] и инактивирует глутатионпероксидазу; образующийся в результате вторичных реакций гид-роксильный радикал НО' эффективно разрушает практически все белки [12, 13].
Показано, что модифицирование ферментов антиоксидантной системы полиэтиленоксидами, полисахаридами, низко- и высокомолекулярными амфифильными соединениями придает им некоторые ценные свойства при использовании их в качестве медицинских препаратов [2, 3, 14].
Совместное введение животным модифицированных су пе роксид и емута з ы и ката л азы усиливает эффективность действия обоих биокатализаторов. В настоящее время созданы антиоксидант-ные комплексы, содержащие супероксиддисму-тазу и каталазу в составе лигюсом ¡15]. Эти же ферменты, соиммоби|изованн ы е на декстранах, применяются при экспериментальном силикозе легких [8]. Полисахарндные носители для ферментов антиоксидантной системы весьма перспективны, так как позволяют создавать как водорастворимые, так и связанные с твердым носителем препараты.
Цель настоящей работы состояла в оптимизации синтеза конъюгатов супероксиддисмутазы и каталазы с альдегиддекстранами (АД), изучении их кинетических свойств и операционной устойчивости полученных соиммобили.зованных ферментов для дальнейшего использования в виде препаратов медицинского назначения. Фундаментальным аспектом работы является поиск путей оптимальной соиммобилизации субъединичных ферментов (супероксиддисмутаза и каталаза) и повышения их операционной устойчивости с учетом суицидной природы обоих биокатализаторов.
При исследовании супероксиддисмутазы и ее модифицированных форм большое значение имеет способ определения активности фермента. Поскольку прямые методы связаны с измерением текущей или стационарной концентрации О
присущая им чувствительность ниже, чем чувствительность косвенных химических методов, в которых определяется все количество Огенерированное в ходе реакции [1 ]. Поэтому в данной работе для определения активности фермента мы использовали косвенный метод, в котором авто-окисляющийся эпинефрин (адреналин) является (при рН > 8.5) эффективной ловушкой радикалов С) ;, участвующих в цепном процессе. При авто-окислении адреналина образуется адренохром, за накоплением которого следят спектрофотомет-рически [1, 16], а активность супероксиддисмутазы определяется по ее способности ингибировать реакцию автоокисления.
При синтезе конъюгатов супероксиддисмутазы использовали окисленные альдегиддекстраны [17] с возрастающей молекулярной массой 15-20, 40 и 70 кДа. Увеличение концентрации Щ104 и времени окисления декстранов первоначально приводило к снижению ферментативной активности полученных конъюгатов (рис. 1). Кова-лентное связывание супероксиддисмутазы с аль-дегиддекстраном можно совместить с периолатным окислением декстрана, т.е. одновременно проводить активацию матрицы и взаимодействие белка с ней (рис. 1, 2). В этом случае приходится примерно в 10 раз увеличить концентра-
Ингибирование, %
9
Ч:_1_^___
1000 2000 [МаЮ4 ] / [декстра 11]
Рис. 1. Ингибирование автоокисления адреналина . конъюгатом супероксиддисмутаза (Е[) - АД70 при концентрации Е,-АД 0.53 (1) и 0.57 мг/мл (2). Условия получения кшъюгата: I - [декстран] 37.6 -251 мкМ, [ЫаЮ4] 0.1 М, инкубация 30 мин, затем до-бавление фермента в соотношении [Е^ДАД] = 2, инкубация 24 ч; 2 - [декстран) 10 мкМ, 1ЫаЮ41 5-94 мМ, [Е|] 20 мкМ, 2 ч.
цию окислителя по сравнению с условиями для предварительной активации полисахарида (зависимость 1). При дальнейшем увеличении соотношения 1Ха104]/[декстран] до значений 600 (кривая 1) и 7000 (кривая 2) наблюдался рост ферментативной активности синтезированных конъюгатов. Это, возможно, связано с деструкцией альдегиддекст-рана в щелочной среде и снижением молекулярной массы образующихся фрагментов окисленного полисахарида [6]. Действительно, из таблицы следует, что с уменьшением молекулярной
Зависимость степени ингибирования конъюгатами супероксиддисмутазы и катал азы с альдегиддекстранами реакции автоокисления адреналина от состава конъюгатов
Конъюгат (система) Исходное мольное соотношение компонентов Ингибирование, %
Е,-АД15 (I) 1 0.5 32.4
Е,-АД40 (II) 1 0.5 27.5
Е,-АД70 (III) 1 0.5 21.1
Е!-АД15-ЕОА (IV) 1 0.5 2500 42.0
Е,-АД40-ЕОА (V) 1 0.5 2500 35.8
В,-АД70-ЕОА (VI) 1 0.5 2500 27.5
Е[-АД15-Е2 (VII) 1 0.5 0.5 52.7
Е,-АД40-Е, (VIII) 1 0.5 0.5 53.0
Е,-АД70-Е2 (IX) 1 0.5 0.5 38.1
Ег-АД15-Е1 (X) 0.5 0.5 1 56.8
Е2-АД40-Е, (XI) 0.5 0.5 1 56.9
Е2-АД70~Е| (XII) 0.5 0.5 1 56.0
рн
7 8 9 10
[буфер; EDA], М
Рис. 2. Влияние условий синтеза конъюгатов (III) (2-4) и (VI) (5,6) на их ингибирующее действие в реакции автоокисления адреналина в сравнении с действием супероксиддисмутазы (/). Условия: [Е[]/[АД] = 2; ¡,4- буфер В (рН 7.4 - 8.0), буфер А (рН 9.0 - 10.2); 2 - буфер Б; 3, 6 - буфер А; 5 - 0.25 М буфер Б.
—L_I__L.
0.5 1.0 1.5
[АД]/[Е,]
Рис. 3■ Влияние соотношения [АД]/[Е] и исходной концентрации №Ю4 при синтезе конъюгатов супероксиддисмутазы (а) и каталазы (б) на их активность, а- [Е,-АД] = 0.53 мкг/мл, [Е1] = 5 мкМ, [АД] = = 0.1-7.5 мкМ, буфер А, [N3104] = 10 (/) или 100 (2) мкМ, время реакции 2 ч; б - [Е2] = 2.6 мкМ, [АД] = 0.13-1.3 мкМ, буфер А, [декстран] = 10 мкМ, [МаЮ4] = 10 (5), 50 (4) или 100 (5) мкМ, время реакции 2 ч.
массы исходных декстранов активность конъюгатов, полученных на их основе, существенно возрастает (системы 1-Ш), т.е. молекулярная масса коваленгно связанного с ферментом модификатора не должна быть слишком высокой. Эта же закономерность прослеживается для конъюгатов Е,-АД, модифицированных этилендиамином (системы ГУ-У1), конъюгатов, содержащих наряду с супероксиддисмутазой каталазу (системы УП-1Х).
Активность конъюгатов Н,-АД (здесь и далее АД = АД70) существенно зависит от значения рН буфера, в котором проводили синтез конъюгата (рис. 2, 4). При рН < 8 скорость реакции между свободными аминогруппами белка и альдегидными группами модификатора снижается. Конъю-гаты Е|-АД, синтезированные при рН 8, по элек-трофоретической подвижности практически не отличались от исходного ^модифицированного фермента, что свидетельствует о модификации относительно небольшого числа аминогрупп. Существенное снижение активности конъюгата Е|,-АД, полученного при рН 10.2, указывает на значительную степень модификации фермента. Учитывая эти данные, в дальнейшем проводили синтез конъюгатов с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.