ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 5, с. 391 - 395
УДК 547,565 2Л8 5 77.352.38
СИНТЕЗ И СВОЙСТВА МЕМБРАНО АДРЕСОВАННЫХ АНТНОКСИДАНТОВ НА ОСНОВЕ ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ
ПИРОКАТЕХИНОВ
© 1995 г. А. А. Ахрем, В. И. Долгоиалец, М. А. Кисель, Н. И. Мезен**, В. А. Тимощук*, А. С. Федулов**, О. И. Шадыро*
Институт биоорганической химии АН Беларуси, Минск * Белгосуниверситет ** Минский медицинский институт Поступила в редакцию 20.07.94 г,
С использованием 3,5-ди-/этрет-бутил-о-хинона в качестве исходного соединения синтезированы амфифильные мембраноадресованные антиоксиданты - 3,5-ди-трет-бутил-2-гидроксифенилфос-фат, (3,5-ди-шрет-бутил-2-гидроксифенил)гексадецилфосфат и (3,5-ди-т/?ет-бутил-2-гидроксифе~ нил)холестерилфосфат, различающиеся гидрофобно-гидрофильным балансом. 3,5-Ди-трет-бу-тил-2-гидроксифенилфосфат и (3,5-ди-т^ет-бутил-2-гидроксифенил)гексадецилфосфат уже в концентрации 10~в М подавляют образование малонового альдегида при перекисном окислении липидов гомогената мозга крыс, инициированном системой Ре2+-аскорбат. При концентрациях ан-тноксидантов в гомогенате мозга 10"4 М и выше образование малонового альдегида замедляется более эффективно, чем при аналогичных концентрациях токоферола.
Ключевые слова: мембраноадресованные антиоксиданты, перекисное окисление липидов, гомоге-ншп мозга.
Свободнорадикальиые реакции, имеющие место в клеточных мембранах человека и животных. играют важную роль в патогенезе воспалительных процессов, рака, ишемической болезни и в развитии дегенеративных явлений, таких, как старение, артрит и иммунодефицит [1 - 3]. К наиболее изученным свободнорадикальным реакциям относится перекисное окисление липидов (ПОЛ) [4, 5). На первой стадии ПОЛ липиды, содержащие остатки полиеновых жирных кислот, превращаются в гидроперекиси. Присутствие в системе ионов металлов переменной валентности способствует развитию цепных реакций, деструктивному распаду гидроперекисей и образованию вторичных продуктов ПОЛ [4, 5]. Недавно мы показали, что свободные радикалы могут вызывать не только ПОЛ, но и фрагментацию ряда фосфоли-тшдов в результате атаки их полярных липидных группировок [6, 7].
В живых клетках существует система подавления свобод нора ди кал ьных процессов, в состав которой входят как полимерные (супероксиддисму-таза, каталаза, глутатионзависимые пероксидазы и трансферазы). так и низкомолекулярные био-антиоксиданты [8, 9). Низкомолекулярные анти-
Сокращения; ПОЛ - перекисное окисление липидов, ТБК -тнобарбитуровая кислота.
оксиданты в свою очередь подразделяются на водорастворимые (витамин С, глутатион) и липо-фильные (витамины А, В и К). Последние ингибируют ПОЛ в гидрофобной области мембран, в то время как гидрофильные антиоксиданты нейтрализуют зарождающиеся в водной фазе активные частицы кислорода [9].
В последние годы многие исследователи заняты поиском синтетических ингибиторов радикальных процессов, которые рассматриваются ими как потенциальные лекарственные вещества для профилактики и лечения патологий, обусловленных сбоями в антиокислительной системе организма. Так, синтезирован ряд прострапст-венно-затрудненных фснольных антиоксидан-тов, эффективно подавляющих ПОЛ [10, 11], а Э.Е. Нифантьевым и сотрудниками предложены так называемые мембраноадресованные антиоксиданты - фосфатидилгидрохиноны и фосфати-дилионолы [12, 13]. Предполагается, что такие соединения будут легче проникать в мембраны и оказывать пролонгированное действие, причем их фосфатцдильный остаток будет выступать си-нергистом пространственно-затрудненной фе-нольной группировки. Недавно высказана гипотеза о наличии антиоксидантных свойств у холестерина, который является одним из главных компонентов мембран клеток животных [14].
Учитывая эти факты и соображения, мы поставили своей целью изучение новых мембраноадресо-ванных антиоксидантов, имитирующих природные фосфолипиды, и синтезировали (3,5-ди-трет-бутил-2-гидроксифенил)гексадецилфосфат (VI) и
(3,5-ди-/?2рет-бутил-2-гидроксифенил)холестерил-фосфат (VII), а также (для выяснения роли гидро-фобно-гидрофильного баланса в ингибИровании ПОЛ) водорастворимый 3,5-ди-лмртг-бутил-2-гидроксифенилфосфат (V).
ОТ ROH
О О
Ч-OR Н2°(Н+). О Bu"
(IVa, б) (V)
(V) R = Н
(IVa), (VI) R = h-C16H33 (1V6), (VII) R = 5-холестен-ЗР-нл
ОН
В качестве исходного соединения для синтеза был выбран 3,5-ди-трега-бутил-о-хинон (I). При его обработке треххлористым фосфором образовывался промежуточный трихлорфениленфос-фат (П), легко переведенный нагреванием с уксусным ангидридом в монохлорфениленфосфат (III). Следует отметить, что обычно соединения типа (Ш) получают из соответствующих пирокатехинов действием РС15 или РС13 с последующим окислением хлором [15, 16]. Наш метод синтеза таких соединений выгодно отличается тем, что реакция протекает количественно, в мягких условиях и при этом легко контролируется но исчезновению интенсивной окраски о-хинона.
Действием гидрофобных спиртов - н-гексаде-канола и холестерина - хлорфосфат (Ш) был превращен в соответствующие триэфиры (IV), кото-
250
290
330 нм
Спектры поглощения 3,5-ди-трет-бутил-2-гидрокси-фенилфосфата (V) в воде (!}, спирте (2), 0.05 И. КОН (3) и 0.05 н. спиртовом растворе КОН (4).
рые без выделения были гидролизованы разбавленной уксусной кислотой до стерически более выгодных ациклических диалкилфосфаТов (VI) и (VII). Аналогично был гидролизован до монофосфата (V) и хлорциклофосфат (III).
Наличие фенольной группировки в соединениях (V) - (VII) было доказано УФ-спектрами (рисунок). Для последних характерны максимум поглощения при 277 - 278 нм, который претерпевает значительный батохромный сдвиг, и увеличение интенсивности поглощения при подщела-Чйвании. В спектрах 'Н-ЯМР соединений (VI) и (VII) присутствуют характерные сигналы ароматических протонов, протонов метальных групп mpem-бутильных заместителей ароматического кольца, мётильных и метиленовых групп холестеринового и гексадеЦильного остатков. Сравнение хроматографической подвижности 3,5-ди-трет-бутил-2-гидроксифенилфосфатом (V) - (VII) и фо-сфатидилхолина на пластинках с тонким Слоем си-ликагеля свидетельствует о сходстве адсорбционных свойств синтезированных нами соединений и природных фосфолипидов (см. табл. 1).
Ингибирование ПОЛ полученными веществами было изучено на гомогенате Мозга крыс. В го-могенате инициировали Ре2+-аскорбатзависимое ПОЛ в Присутствии природного антиоксиданта токоферола и соединений (V) - (VII). Как следует из табл. 2, в сравнении с a-D-токоферолом соединения (V) и (VI) уже при концентрации 10 5 М значительно эффективнее ингибируют накопление активных в тесте с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) продуктов ПОЛ. При концентрации ингибиторов (V), (VI) и (VII), равной 10~3 М,
СИНТЕЗ II СВОЙСТВА МЕМБРАНОАДРКСОВАННЫХ АНТИОКСИДАНТОВ
393
Таблица 1. Физико-химические свойства мембраноад-ресованных антиоксидантов на основе замещенных пирокатехинов
Соединение Rf (ЯРс)* Коэффициент распределения в системе н-бута-нол-вода
(V) 0.32(0.89) 4.5
(VI) 0.61(1.69) 10.6
(VII) 0.68(1.89) 17.0
Фосфатидилхолин (PC) 0.36(1.00) -
* ТСХ на силикагеле в системе растворителей хлороформ-метанол-вода, 65 : 25 : 4 (по объему).
образование ТБК-активных продуктов снижается до 8.5, 5.5 и 18.2% соответственно. При этой концентрации токоферола выход ТБК-активных продуктов составляет 75% от контроля. При низких концентрациях практически не проявляет активности антиоксидант на основе холестерина. По данным распределения в системе н-бутанол~ вода (табл. I), он является самым гидрофобным соединением. По-видимому, в водном растворе ббльшая часть молекул этого соединения подвергается агрегации, что приводит к резкому снижению эффективной концентрации антиоксИданта как в водной фазе, так и в мембране. Соединение (VI), очевидно, хорошо встраивается в мембрану, а водорастворимый антиоксидант (V) распределяется между гидрофобной липидной фазой и водой. Благодаря такому распределению соединение (V) ингибирует зарождение активных частиц кислорода и предотвращает образование конъюгиро-ванных диенов и гидроперекисей фосфолипидов [9, 17].
Основываясь на данных табл. 1 и 2, можно сделать вывод, что мембраноадресованные антиок-
сиданты на основе ди-//г/;ст-бутилзамещенного пирокатехина являются эффективными ингибиторами ПОЛ в биологических мембранах, а их ин-гибирующая активность сложным образом зависит от концентрации и гидрофобно-гидрофиль-ного баланса молекул этих соединений.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали холестерин (Merck, ФРГ), гексадеканол (Fluka, Швейцария), тиобар-битуровую кислоту (Serva, ФРГ), силикагель для колоночной хроматографии с размером частиц 40 - 100 мкм (Chemapol, Чехо-Словакия). 3,5-Ди-mpem-бутил-о-хинон получали но методике, описанной в работе [18].
Спектры 'Н-ЯМР регистрировали на приборе Brucker АС-200. Электронные спектры в ультрафиолетовой области записывали на приборе Specord М-40. ИК-спектры получали с помощью прибора UR-20. Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках Merck с закрепленным слоем силикагеля. Пятна на пластинках обнаруживали с помощью реагента на фосфолипиды [19].
3,5-Ди-т/>е/п-бутил-1,2-фениленхлорфосфат (III). К охлажденному до ~5°С раствору 565 мг 3,5-ди-трет-бутил-о-хинона в 20 мл хлористого метилена постепенно прибавляли при перемешивании 0.25 мл хлористого фосфора (III) в 10 мл хлористого метилена в течение 15 мин. Реакционную смесь доводили до комнатной температуры, а затем кипятили 3 ч с обратным холодильником. При кипячении интенсивная окраска раствора постепенно слабела и к концу нагревания приобретала бледно-зеленый цвет. Растворитель упаривали на роторном испарителе и остаток дважды упаривали с толуолом для удаления остатков РС13. К остатку прибавляли 3 мл толуола, 0.5 г свежеперегнанного уксусного ангидрида, смесь кипятили с обратным холодильником. Через 1.5 ч растворитель удаляли в вакууме, к остатку прибавляли 5 мл толуола и смесь снова упаривали.
Таблица 2. Скорость накопления ТБК-активных продуктов в гомогенате головного мозга крыс при инициации ПОЛ комплексом Бе2+- аскорбат в присутствии токоферола и си
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.