БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 6, с. 454 - 460
УДК 577.113.4
СИНТЕЗ И СВОЙСТВА НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ ХИМИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ УРЕИДНЫЕ ГРУППИРОВКИ
© 1995 г. М. Г. Ивановская*, Н. А. Нарышкин, 3. А. Шабарова
Химический факультет и Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 13.07.94 г. После доработки 15.09.94 г.
Изучена модификация карбоксильной группы, введенной в структуру синтетического дезохсирибо-олигонуклеотида, под действием водорастворимого 1-этил-3-(3'-диметиламинопропил)карбоди-имида (ЕОС). Обнаружено, что при обработке к ар бо к сил со держ а ще го олигонуклеотида ЕОС и иоде и водных буферных растворах происходит быстрое образование соответствующего уреидного производного с выходом 80 - 90%. Показано, что это производное относительно устойчиво в водном растворе и легко может быть выделено методом электрофореза в полиакриламидном геле. Изучена гидролитическая устойчивость этого соединения в широком интервале значений рН. 11оказано, что нового типа уреидные производные устойчивы при нейтральных и слабокислых значениях рН. При слабощелочных значениях рН они способны ацилировать аминосодержащие соединения с высокой эффективностью (50 - 90%). Предложенный тип реагентов может быть использован для аффинной модификации ферментов и других белков и для получения конъюгатов олигонуклеоти-дов с другими классами соединений.
Ключевые слова, производные олигонуклеотидов, у рейды, реагенты для кросс-линкинга с аминами и белками.
Неослабевающий интерес к химии производных олигонуклеотидов обусловлен их широким использованием в самых различных областях современной науки, медицины и биотехнологии. Основной подход для получения модифицированных олигонуклеотидов заключается во включении соответствующего синтона в олигонуклеотид в процессе автоматического синтеза. Однако существует целый ряд производных олигонуклеотидов, которые могут быть получены только путем постсинтетической модификации. Таковыми являются химически активные производные олигонуклеотидов, способные не только узнавать, но и ковалентно связываться с компонентами нуклеиновых кислот и белков. Эти соединения могут использоваться в качестве аффинных реагентов для изучения активных центров ферментов, реагентов для химического лигирования [1], "сен-совых" реагентов, способных специфично взаимодействовать с белковыми молекулами и затем
Сокращения: EDC - 1-этил-3-(3'-диметиламинопропил)кар-бодиимид; 32Р - [,2Р]фосфат; EDA -этилендиамин; MES -морфолинэтансулъфокислота; TBE - трис-боратный буфер. Префикс d (дезокси) в обозначении дезоксирибооли-гонуклеотидов опущен.
* Адрес для переписки: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ,'НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, лаборатория химии нуклеиновых кислот, -Ивановской М.Г.
либо модифицировать их, либо прочно и направленно связываться с ними.
Ряд химически активных производных олигонуклеотидов ранее уже применялся для региоспе-цифических реакций с нуклеиновыми кислотами и белками. Это фосфоазолиды [2], И-оксибеизо-триазоловые фосфодиэфиры [3], олигонуклео-тиды, содержащие межпукле отидные тризаме-щенные пнрофосфатные [4], ацилфосфатные [5] и сложноэфирные связи. Однако проблема получения доступных и эффективных производных, которые можно было бы использовать для решения вышеперечисленных задач, по-прежнему остается актуальной. Одним из решений этой проблемы является использование олигонуклеотидов, содержащих карбоксильные группы. Известно, что карбоксильная группа по химическим свойствам выгодно отличается от фосфомоно-эфирной группы. Это связано с тем, что атом углерода в ней находится в .^-гибридном состоянии, и поэтому сама карбоксильная группа имеет плоскую структуру. По этой причине атом углерода легкодоступен для атакующих молекул, что облегчает протекание реакций присоединения-замещения [6].
В связи с этим представлялось интересным изучить химические свойства карбоксильной группы, специально введенной в состав олигонуклеотида,
Я'-Ы=С=Ы-Я2 + Я3СООН —Я'-Ш—С~Ы-Я2 + Я3СОО~
—- я'-мн-с^-я2
1 1 +Н' 1 ' ^ о
)1 — кти-п=\1о> — ыи г1—\п-; - >2
о-с-я-'
II
(О О
я'-ш-с-м-я2 I! I
О с-я3
Я'-Ш—с—ш-я-1
I ,
о-с-я3 н
О
КиН
(-н+)
о 1
II
№а~-С-Я3+ Я'-Ш-С-Ш-Я2
II
О
(II) о
Я', Я2, Я3 - алкил, арил и другие радикалы; Ый - нуклеофил.
Схема 1.
ОН
О 'т о м О
(^Г Ч. ЕОС 11 А Н2Ы-СН2-СООН
Я-О-Р-О" + ^ Я-О-Р-О-М' 'ы ———-»*- К-0-Р-0-Ш-СН,-С00Н
ОН "" от )=К О"
(III) \ // (IV)
Я - (5') ААААТАСАС
Схема 2.
так как это могло бы привести к получению новых, возможно более активных, производных -реагентов для направленной модификации белков и нуклеиновых кислот.
Химические свойства и реакции карбоксильной группы хорошо изучены в пептидной химии, где синтез ведется, как правило, в безводной органической среде. Для карбоксильной группы в составе олигонуклеотида необходимо рассмотреть реакции, протекающие в водной среде, направление и механизмы которых практически не изучены. Использование водной среды важно как с точки зрения растворимости олиго- и полинук-леотидов, так и с точки зрения использования этих соединений в реакциях с биополимерами, протекающими в условиях, близких к физиологическим.
Наиболее простым реагентом для активации карбоксильной группы в водной среде является водорастворимый 1 -этил-3-(3'-диметиламинопро-пил)карбодиимид, который широко используется для активации фосфомоноэфирной группы оли-гонуклеотидов [7, 8]. Из литературных данных известен общий механизм активации карбоксильной группы под действием карбодиимида [9 - 11] (схема 1).
Вначале из карбоновой кислоты и карбодиимида образуется О-ацилмочевинное производ-
ное (I), соединение очень неустойчивое, которое быстро подвергается дальнейшему превращению по одному из двух путей. В присутствии достаточно сильных нуклеофилов реализуется путь "а", т.е. перенос ацилыюго остатка на нуклеофил, например амин. Однако в отсутствие сильных нуклеофилов О-ацилмочевинное производное либо гид-ролизуется под действием воды, как нуклеофила, с высвобождением исходной карбоксильной группы и мочевины, либо претерпевает О—>-1Ч-сдвиг и переходит в М-ацилмочевинное производное (II) (путь "б")- М-Ацилмочевины (урейды) устойчивы при кислых значениях рН [12] и легко гидролизу-ются в водном растворе ИаОН, образуя мочевину и соль карбоновой кислоты [13]. В работе [9] было отмечено, что К-ацилмочевинные производные в свою очередь могут атаковаться аминами с образованием амидной связи.
В рамках настоящей работы было впервые предпринято изучение химических свойств карбоксильной группы в составе олигонуклеотида. В качестве объекта исследования был выбран девяти-звенный олигодезоксирибонуклеотид со случайной последовательностью: (5') ААААТАОАСр (III) [14]. Для введения в него карбоксильной группы проводили постсинтетическое присоединение аминокислоты по З'-концевому фосфату ранее разработанным нами методом [15] (схема 2).
Рис. 1. Накопление уреидного производного (VI) в МЕв-буфере при рН 6.0, [ЕОС] 0.5 М, 10 °С. Дорожка 1 - исходный олигонуклеотид (V), 2 - продукты реакции через 15 мин, 3- 30, 4 -60,5 - 120 мин. ХС- ксиленцианол.
Соединение (IV) было выделено методом гель-электрофореза в 20% ПААГ и получено с выходом 95%.
Для быстрого и удобного наблюдения за превращениями карбоксильной группы под действием ЕОС в соединение (IV) была введена 5'-копцевая 32Р-метка с помощью [ у-32Р]АТР и Т4~полинук-леотидкиназы [16]: (5') 32рААААТАОАСр-ЫН-СН2-СООН (V). Контроль за ходом реакций вели методом гель-электрофореза в 20% ПААГ с последующей авторадиографией.
Синтез уреидного производного олигонуклеотида (V)
Исходным соединением для синтеза уреидного производного служил описанный выше олигонуклеотид (5') 32рААААТАСАСр-Ш-СНгСООН (V). Ранее соединения подобной структуры мы использовали для ковалентного присоединения некоторых аминосоединений по карбоксильной группе олигонуклеотида в присутствии ЕЭС [15]. При этом соответствующие амидные производные получались быстро и с высокими выходами. В настоящей работе впервые были изучены превращения карбоксильной группы под действием водорастворимого карбодиимида в отсутствие нуклеофильных агентов.
Методом электрофореза в 20% ПААГ мы установили, что обработка соединения (V) ЕЕ)С в
водных буферных растворах приводит к быстрому и почти количественному образованию некоего нового соединения (VI) (рис. 1).
Ранее мы установили, что в использованных условиях ни гетероциклические основания, ни межнуклеотидный фосфат не модифицируются карбодиимидами [17]. Поэтому единственным продуктом, который мог образоваться в этих условиях из соединения (V), является его аддукт с карбодиимидом по карбоксильной группе. В контрольном эксперименте по обработке карбодиимидом в тех же условиях олигонуклеотида, не содержащего карбоксильной группы, никакой реакции не наблюдалось.
Кривые накопления аддукта (VI) в воде и МЕ8-буфере, приведенные на рис. 2, свидетельствуют о том, что скорость накопления продукта модификации примерно одинакова и достигает 90 - 95% за 30 мин. Учитывая описанный выше механизм модификации карбоксильной группы карбодиими-дами (схема 1), можно предположить, что полученный нами продукт (VI) представляет собой либо 0-ацилмочевинное производное типа I, либо 1Ч-ацилмочевипное производное типа II. Полученное нами соединение может быть легко выделено осаждением 2 М 1лСЮ4/ацетоном, гель-фильтрацией на биогеле Р2, элюцией 2 М 1лС104 из ПААГ. Устойчивость полученного соединения в водной среде в течение недели при 4°С и в условиях
электрофореза в 20% ПААГ свидетельствует о том, что оно является №-ацилмочевиной:
0 О СпНс
п и Л2 5
Я-О-р-Ш -СН2-С-И
1 4
О- />о
НМ^ + ^СНз
ЧСН2СН2СН2ЫН/ СГ (VI) ЧСН3
К = (5') 32рААААТАС-АС
Поскольку такие уреидные производные оли-гонуклеотидов ранее никем описаны не были, мы провели исследование некоторых химических свойств уреида (VI). Прежде всего мы изучили взаимодействие полученного нами продукта (VI) с различными аминосоединениями и его г
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.