»
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 10, с. 774 - 780
УДК 547.963.32.057:542.95
СИНТЕЗ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И ПОЛУЧЕНИЕ ИЗ НИХ ДУПЛЕКСА С КОВАЛЕНТНО СВЯЗАННЫМИ ЦЕПЯМИ
© 1995 г, С. И. Анцыпович, Е. М. Волков, Т. С. Орецкая#, Е. А. Романова, В. Н. Ташлицкий, М. Блюменфельд*, 3. А. Шабароиа
Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова 119899, Москва, В-234, Воробьевы горы, МГУ, химический факультет; * Корпорация "СепзеГ, Париж Поступила в редакцию 21.12.94 г.
Разработан способ синтеза ДНК-дуплекса с ковалентно связанными цепями, изучены его термическая и гидролитическая устойчивость. Связь образована между алифатической аминогруппой, расположенной в одном из тяжей, и карбоксильной группой - в другом, с использованием водорастворимого карбодиимида в качестве конденсирующего агента. Описан синтез серии модифицированных олигонуклеотидов длиной от 5 до 26 нуклеотидных звеньев, несущих первичную амино- или карбоксильную1 группу, исследованы их свойства.
Ключевые слова: модифицированные олигонуклеотиды, 2'-амино-2'-дезоксицитидин, ДНК-дуп-лекс с ковалентно связанными цепями.
Широкое применение олигонуклеотидов в мо-л е кулярно- би о л огическ их исследованиях стимулирует интерес к совершенствованию методов синтеза этих соединений и изучению их свойств. В последнее время получило развитие новое направление в химии нуклеиновых кислот, связанное с дизайном и синтезом модифицированных олигонуклеотидов, обладающих специфическими свойствами - устойчивостью к нуклеазной деградации, возможностью проникновения через клеточную мембрану, способностью связываться ковалентно с молекулами ДНК и белков [1, 2]. Создание новых соединений с заданными химическими, физико-химическими и биологическими свойствами является актуальной задачей.
В настоящей работе предлагается новый подход к синтезу модифицированного ДНК-дуплекса, тяжи которого соединены ковалентной связью. Особенностью предлагаемого нами подхода является возможность образования связи между цепями в любом заранее заданном месте ДНК-дуплекса, в том числе введение множественных сшивок. Субстраты подобной структуры могут найти применение при изучении НК-белковых
Сокращения: DMTr - 4,4'-диметокситритил; Fmoc - 9:флуо-ренилметоксикарбонил; FITC - флуоресцеинизотиоциа-нат; CDI - 1-этил-3-(3,3-диметиламинопропил)карбоди-имид; MES - морфолинэтансульфокислота;. НК - нуклеиновые кислоты. Префикс "d" (дезокси) при обозначении 2'-дезоксирибонуклеозидов и олигодезоксирибонуклеоти-дов опущен. Автор для переписки.
взаимодействий. Известны работы, в которых описано получение ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями, где для введения связи между тяжами используются модификации гетероциклических осНЬваний (цитозина или гуанина) [3 - 5]. Это не только нарушает водородные связи в месте сшивки, но и существенно ограничивает дизайн дуплексов.
Целью настоящей работы является:
1) разработка методов получения модифицированных мономерных синтонов и использования их для амидофосфитного синтеза взаимокомплементарных олигонуклеотидов, несущих карбоксильную и аминогруппы;
2) осуществление реакции между цепями оли-гонуклеотидного дуплекса, составленного из этих модифицированных олигонуклеотидов, отработка условий данной реакции и изучение свойств полученного сшитого дуплекса.
Синтез модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов
Нами был сформулирован ряд требований к модифицированным олигонуклеотидам, которые определили выбор введенных в олигомеры функциональных групп: а) возможность направленного включения этих групп в любое заранее заданное положение олигонуклеотидной цепи; б) встраивание нескольких групп для получения олигонукле-отидного дуплекса, сшитого в нескольких местах.
СИНТЕЗ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
775
При этом стандартные процедуры автоматического амидофосфитного олигонуклеотидного синтеза сохраняются.
На основании перечисленных условий нами были выбраны следующие типы модификаций олигонуклеотидов. В одну из олигонуклеотидных цепей, предназначенных для получения сшитого дуплекса, вводился 2'-амино-2'-дезоксицитидин [6]. Олигомеры (I) и (II) (таблица) являлись модельными соединениями, а олигонуклеотид (III) - целевым, на котором отрабатывались условия реакции между тяжами дуплекса, ß другой тяж олигонуклеотидного дуплекса вводили первичную алифатическую аминогруппу, локализованную на ненуклеозидной вставке. Соответствующий ами-дофосфитный синтон (6) получали из N-Fmoc-бло-кированного активированного эфира ß-аланина (2) и диметокситритильного производного 2-ами-но-1,3-пропандиола (4) (схема 1).
Целевое соединение (6), содержащее защищенную первичную алифатическую аминогруппу, использовали в стандартных условиях автоматического амидофосфитного олигонуклеотидного синтеза для введения модификаций в заранее заданное место олигонуклеотидной цепи. В структуре данного ненуклеозидного модифицирующего реагента мы сохранили характерную для природных нуклеозидов дистанцию в три углеродных атома между 3'- и 5'-гидроксилами, участвующими в построении межнуклеотидной связи.
С использованием соединения (6) были получены четыре модифицированных олигонуклео-
Первичная структура синтезированных модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов
Олигонуклеотид Первичная структура 5' - 3'
(I) TTCnTT
(II) АААААААСТ
(Ш) ATCCTATAATGCGCnCCTGCA
(IV) TNTTT
(V) TTTTTNT
(VI) GGTNTGGTTAATGATCTACANTTAAT
(VII) TGCAGGNCGCATTATAGGAT
(VIII) ATCCTATAATGCGCCCCTGCA
(IX) TGCAGGNCCGCATTATAGGAT
(X) TGCAGGGCGCATTATAGGAT
(XI) ATCCTATAATGCGCCCTGCA
Примечание. С" - 2'-амино-2'-дезохс.ицитидин; N - ненуклео-зидная вставка с аминогруппой; Сс - 2'-(3-карбоксипропи-ониламино)-2'-дезоксицитидин; N° - ненуклеозидная вставка, имеющая 3-карбоксипропиониламиногруппу.
тида (IV - VII), структуры которых приведены в таблице. Олигонуклеотиды (IV - VI) являются моделями, на которых отрабатывались приемы синтеза, выделения и анализа модифицированного олигонуклеотидного материала; олигонуклеотид (VII) - целевой продукт, с которым проводились дальнейшие эксперименты по получению ковалентно сшитого ДНК-дуплекса. Олигонуклеотид (VI) демонстрирует возможность осуществления множественных включений в олигомеры фрагментов подобной природы.
NH2—(СН2)2-С-ОН
о «
.со
1) Fmoc -O-N ^(СН2)2
ХСО
2) «-NO2-Q5H4OH
Fmoc-NH-iCH^j-C-O-C^-NOz +
НО-СН2 -сн-сн2 - он
вд ® о
II
1) CF3C-OC2H5
2) DMTrCl
3) NH4OH
DMTr-O-CH, -СН-СН, -ОН
О
(2)
I
NHi
(4)
DMTr-0-CH2-CH-CH2-0H
(5)
Fmoc -NH-(CH2)2-C-NH О
C1 I
¿Pr2NPO(CH 2)2CN DMTr-0-CH2-CH-CH2-0-p-0-(CH2)2CN
(6)
I
Fmoc —NH—(CH2)2—C_NH Ö
Схема 1.
I
;Pr,N
мин
Рис. 1. Сравнение хроматографической подвижности (ион-парная ВЭЖХ) олигонуклеотидов (III), (VIII), (III) + (VIII) (условия ВЭЖХ см. в "Экспер. части").
Наличие встроенной в модифицированные олигонуклеотиды (I - VII) реакционноспособной первичной алифатической аминогруппы было показано при взаимодействии с электрофильны-ми реагентами: уксусным ангидридом (с последующим анализом продуктов реакции методом ион-парной ВЭЖХ) и FITC (по методике [7] с последующим спектрофотометрическим анализом продуктов). В спектре поглощения продукта реакции с F1TC обнаружили два максимума при 260 и 495 нм, относящиеся к олигоиуклеотидной и флу-оресцеиновой частям соответственно,
Далее реакцией с янтарным ангидридом в модифицированные олигонуклеотиды (III, VII) вводилась карбоксильная группа.
Время удерживания модифицированных олигонуклеотидов при анализе методом ион-парной ВЭЖХ изменялось в полном соответствии с природой введенных функциональных групп: так, олигонуклеотиды (I - VII) с аминогруппой имели, как правило, меньшее время удерживания по сравнению с природными олигонуклеотидами с аналогичной первичной структурой из-за дополнительного положительного заряда, тогда как олигонуклео-тиды с карбоксильной группой (VIII, IX) - большее благодаря дополнительному отрицательному заряду (см., например, рис. 1).
Получение олигонуклеотидного дуплекса с ковалентно связанными цепями
Из синтезированных модифицированных взаимокомплементарных олигонуклеотидов (III, IX) и (VII, VIII) были составлены два ДНК-дуплекса (В и С соответственно), в каждом из которых одна из цепей содержала аминогруппу, а вторая -карбоксильную группу (схема 2). Различие между данными дуплексами заключалось в том, что в дуплексе В свободной была 2'-аминогруппа цити-дина, тогда как в дуплексе С - аминогруппа, локализованная на ненуклеозидной вставке.
Реакцию между цепями осуществляли в течение 6 сут при 4°С с использованием водорастворимого С01 в качестве конденсирующего агента в водном буферном растворе, рН 6.7. Реакционные смеси анализировали с помощью ион-парной ВЭЖХ (см., например, рис. 2). Выход целевого продукта определяли как отношение площади пика, соответствующего сшитому дуплексу, к сумме
3' taggatattacgcgggacgt 5' (x) 5' atcctataatgcgccctgca 3' (xi)
3' taggatattacgc-0-ch2-ch-ch,-0-ggacgt 5' (ix)
I
NH I
в
о о
II II
o=c-ch2-ch2-nh-c-ch2-ch2-c-oh
Cyt
-nh2
—o-cctgca 3' (III)
5' дтсстатаatgcg- 0~ ch2
3' taggatattacgc-0-ch2-ch-ch",-0-ggacgt 5' (vii)
I
nh
г ¿¿¿
cvt о о
-yl II II
—nh-c-ch2-ch2-c-oh
—o-cctgca 3' (VIII)
5' atcctataatgcg-o-ch2--
Схема 2.
синтез модифицированных олигонуклеотидов
777
площадей пиков, соответствующих исходному и конечному соединениям, рассчитанных с использованием программы Maxima ("Waters"). Выход ковалентно сшитого дуплекса в случае использования олигонуклеотидов (VII) и (VIII) составил 3%, а в случае олигонуклеотидов (III) и (IX) - 16%. Такое существенное различие в выходе целевого продукта объясняется уникальными свойствами 2'-аминогруппы в остатке 2'-дезоксицитидина, рК которой значительно ниже, чем у первичной алифатической аминогруппы (7, 4 [6] и 11 соответственно). Поэтому в условиях реакции 2'-амино-группа в значительной степени остается в свободной непротонированной форме и таким образом сохраняет свою нуклеофильность. Целевые продукты анализировали методом электрофореза в 20% П ААГ (рис. 3). Дорожка D соответствует ковалентно сшитому дуплексу D, выделенному с помощью ион-
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.