ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 4, с. 429-436
УДК 579.66/615.375
СИНТЕЗ МОДИФИЦИРОВАННЫХ, УСТОЙЧИВЫХ К ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ ДЕГРАДАЦИИ ИНТЕРФЕРОНОВ-ГАММА
В ДРОЖЖАХ Pichia pastoris
© 2014 г. М. А. Цыганков, А. Е. Зобнина, М. В. Падкина
Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, 199034
e-mail: tsygankov@yandex.ru Поступила в редакцию 18.11.2013 г.
Получены модифицированные гены бычьего и куриного гамма-интерферона, кодирующие белки, лишенные в С-концевой части потенциальных сайтов расщепления протеазами. Созданы штаммы дрожжей Pichia pastoris — продуценты укороченных форм бычьего и куриного гамма-интерферона. Показано, что рекомбинантные белки с привнесенными модификациями обладают повышенной стабильностью и при этом сохраняют биологическую активность. Это позволяет использовать созданные штаммы для получения очищенных препаратов бычьего и куриного гамма-интерферона для их применения в ветеринарии.
DOI: 10.7868/S055510991404028X
Гамма-интерферон (иммунный интерферон; ИФН-у) принадлежит к семейству цитокинов, обладающих широким спектром биологической активности. Он является активатором специфического клеточного иммунитета, стимулирует ци-тотоксичность макрофагов, повышает устойчивость организма к различным инфекциям [1, 2].
Иммунные ИФН-у птиц и млекопитающих повышают бактерицидную и фунгицидную активность макрофагов и являются эффективными препаратами для лечения различных заболеваний животных [3, 4]. Использование ИФН-у для лечения заболеваний различной этиологии имеет существенные преимущества по сравнению с традиционными антибиотиками и химиотерапевтиче-скими препаратами вследствие широкого спектра действия, обусловленного активацией иммунной системы, и отсутствия побочных эффектов. Кроме того, использование антибиотиков в терапии бактериальных инфекций у животных, имеющих пищевую ценность, может привести к появлению в пищевой цепи устойчивых к лекарственным препаратам микроорганизмов.
Имеются данные о том, что использование куриного ИФН-у в качестве адъюванта усиливает иммунный ответ организма на вакцины [5]. Это позволяет предположить, что бычий ИФН-у также можно использовать при вакцинации крупного рогатого скота.
Поскольку цитокины обладают широким спектром действия, то естественно возникла проблема получения значительных количеств этих биологически активных соединений. Эта проблема не могла быть решена традиционным способом, включа-
ющим выделение их из крови, вследствие ограниченности ресурсов донорской крови, а также опасности распространения вирусов. С разработкой методов генной инженерии появилась возможность клонировать и экспрессировать чужеродные гены в различных прокариотических и эукари-отических клетках-хозяевах. Впервые препараты рекомбинантных цитокинов были получены из бактерий Escherichia coli [6]. Однако E. coli являются условно патогенными микроорганизмами, и получаемый белок не удается полностью очистить от продуктов жизнедеятельности бактерий, поэтому препарат в той или иной степени становится токсичным, что значительно усложняет применение его в медицине и ветеринарии.
Применение непатогенных микроорганизмов (дрожжей), не содержащих токсические и пиро-генные факторы, как продуцентов рекомбинант-ного иммунного интерферона позволяет использовать этот белок в качестве лекарственного средства.
В работе [7] представлены данные об увеличении активности и устойчивости ИФН-у человека, после укорочения белка с С-конца. Анализ полученных авторами образцов белков методами контроля медицинских и иммунобиологических препаратов, вводимых людям (МУК 4.1/4.2.588-96) показал отсутствие иммуногенности. Известно, что иммуногенность гетерологичных белков, синтезируемых дрожжами Saccharomyces cerevisiae, может быть обусловлена их гипергликозилированием и присутствием в составе углеводного компонента терминальных а1,3-связанных маннозных остатков [8]. Белки, синтезируемые дрожжами Pichia
pastoris, не подвергаются гипергликозилирова-нию и не содержат иммуногенных маннозных остатков, поэтому их можно использовать в медицинской практике [9]. Учитывая данные об отсутствии иммуногенности у укороченного ИФН-у человека и особенности системы экспрессии дрожжей P. pastoris, можно полагать, что модифицированные ИФН-у не являются антигенами.
Ранее гены бычьего и куриного ИФН-у были клонированы в составе векторов, обеспечивающих продукцию рекомбинантного белка клетками дрожжей Р. pastoris и секрецию синтезированного белка в культуральную жидкость [10]. Однако результаты опытов показали, что ИФН-у подвержен существенной протеолитической деградации, обусловленной наличием нескольких потенциальных сайтов узнавания протеазами, два из которых расположены на С-концевой части его молекулы [11].
Цель работы — создание штаммов дрожжей P. pastoris — продуцентов бычьего и куриного ИФН-у — и получение рекомбинантных белков с привнесенными модификациями, ведущими к повышению стабильности продукта при сохранении его биологической активности.
МЕТОДИКА
Плазмиды. Ген bIFNGA30, кодирующий структуру укороченного ИФН-у быка, амплифициро-вали при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя в качестве матрицы плазмиду рВЮ [12], содержащую полноразмерный ген бычьего ИФН-у, а в качестве праймеров следующие олигонуклеотиды:
5'-ССОСТСОЛОЛЛЛЛОЛСДОООССЛДТТТ-З' - прямой праймер, 5'-ООЛЛТТСЛТТЛСЛТООЛТОСЛОЛЛСССТТССТ-3' - обратный праймер.
Прямой праймер содержал сайт узнавания для ре-стриктазы ХИо1, а обратный праймер — сайт узнавания для рестриктазы EcoRI.
Гены ЖИ№-А36, chIFNG-Д33с, chIFNG-Д33g, кодирующие укороченный куриный ИФН-у, также получали с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду рСИЮ, имеющую в своем составе полноразмерный ген куриного ИФН-у
chIFNG [13]. В качестве прямого праймера для всех трех вариантов использовали олигонуклео-тид 5'-CCGCTCGAGДДДAGACATACTGCДAG-TAGT-3, который содержал сайт узнавания для рестриктазы ХИо1.
Для получения трех различных модификаций гена chIFNG в качестве обратных праймеров использовали олигонуклеотиды следующих составов:
5'-GGAATГCTTATTTGAAACГCGGAGGATCC-3' (cЫFNG-Д36); 5'-GGAATTCTTAACATTTGAAACГCGGAGGAT-3'(cЫFNG-Д33с); 5'-GGAATTCTTATTGTTTGAAACTCGGAGGAT-3' (chIFNG-Д33g),
имеющие сайты узнавания для рестриктазы EcoRI на 3'- конце.
Для амплификации фрагментов ДНК проводили 30 циклов реакции в амплификаторе Techne ТС-3000 ("Daigger", США) по следующей программе: плавление цепей ДНК при 95°С в течение 40 с, отжиг праймеров в течение 60 с при температуре 41°С, полимеразная реакция при 72°С в течение 60 с. После окончания ПЦР пробу инкубировали при 72°С в течение 5 мин.
В результате был получен ген bIFNG-Д30, имеющий делецию тридцати пар нуклеотидов на 3'- конце и три модифицированных гена chIFNG: chIFNG-Д36 с делецией 36 п.н., chIFNG-Д33с, chIFNG-Д33g с делецией 33 п.н. и триплетами, кодирующими цистеин и глютамин, соответственно, на 3'- конце.
Полученные гены встраивали в плазмиду рР1С9 ("Invitrogen", США), гидролизованную эндо-
нуклеазами рестрикции Х^1 и EcoRI. В результате были сконструированы рекомбинантные плазми-ды рВЮё10, р^Ю-ё1, р^Ю-ё2 и р^Ю-ё3, содержащие модифицированные гены под контролем промотора и терминатора гена алкогольок-сидазы 1 дрожжей P. pastoris (ЛОХ1). Использование промотора гена ЛОХ1 позволяло регулировать экспрессию клонированных генов источником углерода. На необходимость подобной регуляции указывали полученные нами данные о токсичности рекомбинантного Р-ИФН для клеток дрожжей-сахаромицетов [14]. Присутствие в плазмиде сигнального пептида а-фактора дрожжей S. cere-visiae обеспечивало секрецию рекомбинантного белка в культуральную жидкость.
Штаммы, среды. В качестве реципиента был использован штамм дрожжей Р. pastoris GS115 (his4) ("Invitrogen", США). (his4 — мутация, отвечающая за потребность в гистидине).
Для выращивания дрожжей P. pastoris использовали полную среду BMGY, содержащую на 1 л дистиллированной воды: дрожжевой экстракт — 10 г, пептон - 20 г, КН2РО4 - 3.75 г, К2НРО4 • 3Н2О - 12 г, MgSO4 • 7H2O - 0.5 г, CaSO4 • H2O - 0.4 г, (NH4)2SO4 -3 г, FeSO4 • 7H2O - 16.25 мг, CuSO4 • 5H2O - 1.5 мг, ZnSO4 • 7H2O - 5 мг, MnSO4 • H2O - 0.75 мг, био-тин - 50 мг, глицерин - 10 г. Биомассу выращивали в течении 48 ч при 30° C и перемешивании (150 об/мин).
Для индукции экспрессии гена иммунного интерферона быка, находящегося под контролем промотора гена AOX1, клетки дрожжей переносили в среду, содержащую в качестве источника углерода вместо глицерина 1% метанола. Понижали температуру до 20°C и культивировали еще 48 ч с сохранением интенсивности перемешивания.
Для селекции трансформантов, имеющих фенотип Mut-, использовали минимальную среду, содержащую 0.5% метанола в качестве единственного источника углерода, Среда содержала на 1 л дистиллированной воды: КН2РО4 - 0.85 г, К2НРО4 • 3Н2О - 0.20 г, MgSO4 • 7H2O - 1.03 г, СаС12 - 0.10 г, NaCl - 0.10 г, (NH4)2SO4 - 5 г, тиамин - 200 мкг, ß-аланин - 500 мкг, биотин - 2 мкг, агар - 25 г.
При выращивании штамма GS 115, несущего мутацию в гене HIS4, в среду добавляли 20 мг ги-стидина на 1 л среды.
Для амплификации плазмидной ДНК использовали штамм DH5a E. coli (F'/endA1 hsdR17
(rkm+)supE44thi-1 recAlgyrA (Nalr) relAl A(lacZYA-argF)U169deoR ($80dlacA(lacZ)M15) [13].
Культивирование бактерий проводили в среде Луриа-Бертани (LB) [15]. Для отбора трансформантов штамма DH5a в среду LB добавляли ампициллин в концентрации 35-50 мг/л.
При работе на чашках Петри во все среды добавляли 20 г агара на 1 л среды. Выращивание штаммов E. coli проводили при 37°C.
Выделение ДНК. Плазмидную ДНК из E. coli выделяли стандартным методом [15]. Хромосомную ДНК дрожжей выделяли по методу, предложенному Фуджимура и Сакума [16].
Трансформация. Трансформацию бактерий проводили по стандартному протоколу [15]. Для трансформации дрожжей использовали ранее предложенную методику [17].
Анализ рекомбинантных ИФН-у быка и курицы. Содержание рекомбинантных белков в культураль-ной жидкости штаммов GS115/pBIGd10 и GS115/pChIG-d1, GS115/pChIG-d2, GS115/pChIG-d3, синтезирующих и секретирующи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.