БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 7, с. 5/7 - 523
УДК 547.466.22
СИНТЕЗ ОКТАДЕЦИЛОВЫХ ЭФИРОВ ГИДРОФОБНЫХ ПРОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ
© 1995 г. Ф. X. Исхакова*, О. В. Есипова, Е. Н. Звонкова
Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова,
117571, Москва, просп. Вернадского, 86 Поступила в редакцию 20.06.94 г. После доработки 26.01.95 г.
Разработаны схемы синтеза октадециловых эфиров гидрофобных пептидов, содержащих ¿-пролин, и получены их дейтериймеченые аналоги. С помощью 'Н- и 13С-ЯМР-спектроскопии отмечено наличие цис-транс-конформеров по связи Х-Рго.
Ключевые слова: пролин; пролинсодержащие пептиды; цис-транс-изомерия связи Х—Рго; ИМР; 'Н и 13 С.
Недавно было показано, что ферментативным гидролизом казеинов молока можно получить ряд биологически активных пептидов, обладающих опиоидными, иммуностимулирующими свойствами, а также способностью ингибировать ан-гиотензинпревращающий фермент [1 - 4J. Было обнаружено, что введение в подобные пептиды остатка высшей жирной кислоты облегчает их проникновение в мембрану и пролонгирует их действие [5 - 7].
Ранее нами были получены N-стеароил- и О-октадецилпроизводные гидрофобного пептида Gly-Leu-Phe из казеина, обладающего иммуностимулирующим действием [8], а также их дейтери-рованные аналоги для изучения взаимодействия с фосфолипидным бислоем методами ЯМР на ядрах Н и 31Р [9]. Наше внимание привлек фрагмент Phe-Pro-Gly из последовательности ß-казо-морфина. ß-Казоморфин (Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile) - продукт ферментативного гидролиза ß-казеина, проявляющий опиоидные эффекты in vivo и in vitro, а его N-концевой пентапептид имеет активность в 10 раз большую, чем сам ß-казомор-фин [2]. Совпадающая с этим фрагментом по аминокислотному составу последовательность Pro-Gly-Phe часто встречается в нативном прокол-лагене, а также является фрагментом нонапептид-ного гормона брадикинина Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg [10]. Мы решили синтезировать ряд гидрофобных пептидов, соответствующих упомянутым трипептидным фрагментам ß-казо-
Сокращения: TFA - трифторуксусная кислота, HOBT -i-гидроксибензотриазол, JBC - изобутилхлоркарбонат, Рас - фенацил, THF - тетрагидрофуран, (М) и (т) - мажорные и минорные сигналы в спектрах 'Й-ЯМР, Gly* -Phe* - (С62Н5]фенилаланин, Ode - октадецил.
* Автор для переписки.
морфина и брадикинина, а также их ретропосле-довательности и дейтериймеченые аналоги в виде октадециловых эфиров для изучения их свойств в модельных мембранных системах [9].
Нами были синтезированы октадециловые эфиры ди- и трипептидов, содержащие фрагменты Pro-Gly или Gly-Pro (схемы 1 и 2). Известно, что синтез, удаление защитных групп и очистка пептидов, содержащих связь Pro-Gly, обычно сопровождаются рядом побочных реакций, что ведет к снижению выхода синтезируемых соединений по сравнению с пептидами, содержащими связь Giy-Pro, в силу меньшей лабильности последних [11]. Однако использование нами октаде-цилового эфира в качестве постоянной защитной группы остатков Pro или Gly привело к устранению различий в синтезе этих дипептидных фрагментов (П - V, IX, X) и трипептидов на их основе (VI-VIII, XI-XIII).
Октадециловые эфиры глицина в меченом и немеченом вариантах были приготовлены прямой этерификацией 1-октадеканолом в присутствии п-толуолсульфо кислоты в качестве катализатора [12]. Октадециловый эфир L-пролина был синтезирован по методу Позднева с использованием ди-трет-бутилпирокарбоната [13]. Вос-Gly*-OH и Boc-I-Phe*-OH также получали с применением этого реагента [14].
На стадии синтеза дипептидов успешным оказался как метод смешанных ангидридов с помощью изобутилхлоркарбоната в присутствии N-метилморфолина, так и дициклогексилкарбо-диимидный метод с использованием в качестве добавки 1-гидроксибензотриазола. При синтезе Boc-Pro-G1y-OOde (IX) методом смешанных ангидридов непрореагировавший смешанный ангидрид Вос-Рго и изобутилугольной кислоты (XIV)
Рго
Вос-Вос-
-ОН 1-Н
Вос-Вос-
-ОН } ■ н
(I)
(1а)
(И)-(У)
(Па) т
(VI)-(VIII)
-ОН
-ООйе
-ооае
-ОШе -ООёе -00<5с
Соединение С г ] Метод синтеза или реагент Выход, %
(I) - - - (Вос)20 83
(1а) - - ТРА ТРА 97 .
(И) ау - г осс/новт 85
1ВС 79
(1П) в1у* - ъ ОСС/НОВТ 89
(IV) С1у - Вое 1ВС 71
(V) ету* - Вое 1ВС 80
(На) Иу - НВг НВг/СН3СООН 84
(Ша) С1у* - НВг » 90
(1Уа) С1у - ТБА ТРА 98
(Уа) С1у* - ТРА » 97
(VI) Иу РИе - БСС/НОВТ 68
(VII) Ыу* РИе - ОСС/НОВТ 57
(VIII) Оу РЬе* - ОСС/НОВТ 45
Примечание. Звездочкой помечены дейтериймеченые остатки. Схема 1.
Рго
Вое-Вос-ТКА-Н-
Вос-Вос-
-ОНТРА- Н-
-он н-
(IX), (X)
(1Ха), (Хп)
(XI)-(XIII)
(ХГа) - (ХШа)
-00<1е -00<1е
-ООс1е
-OOde
-ооае
Соединение в Р Метод синтеза или реагент Выход, %
(IX) (Пу тс 86
(X) С1у* - 1ВС 72.5
ОХа) С1у - ТРА 97
(Ха) С1у* - ТРА 98
(X!) й1у РИе ОСС/НОВТ 75
(XII) 01у* РЬе ОСС/НОВТ 68
(XIII) С!у РЬе* ОСС/НОВТ 59
(Х1а) С1у РЬе ТРА 95
(ХЯа) РЬе ТРА 96
(ХШа) Оу РЬе* ТРА 92
Примечание. Звездочкой помечены дейтериймеченые остатки. Схема 2.
был выделен и охарактеризован с помощью 'Н-ЯМР-спектроскопии. Несмотря на устойчивость данного смешанного ангидрида, выход соединения (IX) был достаточно высоким (86%).
Октадециловый эфир глицилпролина был синтезирован как в виде Вое- (IV, V), так и в виде 2-производных (II, III), причем 7-С1у-Рю-ООбе (И) был получен методом смешанных ангидридов и карбодиимидным методом. При использовании БСС/НОВТ-метода (см. схему 1) выходы были несколько более высокими и достигали 85 - 89% по сравнению с методом смешанных ангидридов (71 - 80%). Бензилоксикарбонильную защитную группу соединений (И, III) удалось снять лишь в достаточно жестких условиях (НВг в уксусной кислоте). Попытки удалить ее мягким каталитическим гидрогенолизом не увенчались успехом даже за 24 ч, хотя у 2-С1у-Рго-ОМе Х-защита удалялась в подобных условиях за 30 мин. Поэтому во всех остальных случаях мы использовали трет-бутилоксикарбонильную группу, учитывая легкость удаления и более высокие выходы (например, в случае соединений (IVа) и (Уа)) при обработке трифторуксусной кислотой в хлористом метилене.
На стадии получения трипептидов предпочтение было отдано РСС/НОВТ-методу. Более низкие выходы при получении Вос-Р11е-01у-Рго-00<1е (VI) и его дейтериймеченых аналогов (VII, VIII) по сравнению с Вос-РЬе-Рго-01у-00(1е (XI) и его аналогами (XII, ХШ), вероятно, могут быть объяснены конформационными особенностями амино-компонента: остаток пролина в Н-01у-Рго-00<1е (Па) придает молекуле свернутую конформацию и, по-видимому, делает аминогруппу глицина сте-рически более труднодоступной, чем иминогруп-па пролина в Н-Рго-СИу-ОСМе (1Ха).
Конформационные особенности Рго-содержа-щих пептидов, связанные с возможностью цис-171 ранс-из оме ризации имидной Х-Рго-связи, как известно, проявляются в спектрах 'Н- и °С-ЯМР соответствующих производных [15 - 18]. Так, для Вос-Рго-ОСМе (1) мы наблюдали два синглетных сигнала (мажорный (М) и минорный (т)) протонов Вос-группы в области 1.40 и 1.45 м. д. соответственно с соотношением интегральных интенсив-ностей 3 : 2 (10 - 50 мг/мл, СВС13). Сигналы а СН2 алкильной цепи и а-СН остатка Рго имели характер сложных мультиплетов при 4.1 и 4.25 м. д. соответственно, которые после удаления Вое-защиты упрощались до хорошо разрешенного триплета а-СН2 алкильной цепи при 4.2 м. д. и уши-ренного сигнала а-СН остатка-Йо фи 4.43 м. д. (см. рисунок). Этот результат можно объяснить отсутствием возможностей ц«с-трямс-изомери-зации для деблокированного эфира, что соответствует данным, приведенным в литературе для
(М)
4 3 2 1
'Н-ЯМР-спектры Вос-Рго-ОСМе (а) и-Н-Рго-00(1е (б) в С0С13 + гексаметилдисилоксан.
О м. Д.
других эфиров Вос-Рго-СЖ, например фенаци-ловых (К = СН2СОС6Н5) [15].
Наиболее выраженные различия цис-транс-изомеров Х-Рго наблюдаются по химическим сдвигам (3- и у- углеродных атомов пирролидиново-го кольца в 13С-ЯМР-спектре: сигнал р7СН2-атома цис-изомера смещен на 0.5 - 1.8 м. д. в сторону более слабого поля по сравнению с сигналом трансизомера. Наоборот, сигнал у-СН2-атома цис-изо-мера смещен в сторону более сильного поля по сравнению с соответствующим сигналом транс-изомера [18].
В 13С-ЯМР-спектре Вос-Рго-ООс1е (I) мы наблюдали сигналы в области 24.70 и 30.41 м. д. для транс-конформера и сигналы 24.02 и 31.37 м. д. для ^ис-конформера. Любопытно, что цг/с-кон-формер Вос-Рго-ОСМе явно преобладает над трянс-конформером в условиях съемки спектра |3С-ЯМР (СВС13, 50 мг/мл), тогда как, например, для Вос-Рго-ОРас авторы работы [15] наблюдали доминирование траноконформера в тех же условиях съемки спектра. Наши расчеты различных конформаций молекулы Вос-Рго-ОСМе с помощью программы для персонального компьютера
Характеристические мажорные (М) и минорные (т) сигналы (5, м. д.) в 'Н-ЯМР-спектрах цис-тра«с-ко нфор мерой пептидов,* содержащих связь X—Pro
Номер соединения Соединение (CH3)3COCO- асн Pro Соотношение интеисивностей мажорного и минормого сигналов М : m
(I) Boc-Pro-OOde 1.40 (M) 4.18 дд (М) 1 ■ ?
1.45 (ш) 4.30 дд (ш) ■J .
(IX) Boc-Pro-Gly-OOde 1.45 4.3 ушир. -
(XIV) Boc-Pro-OCOOBu' 1.41 (М) 4.27 к (М) 4: 1
1.43 (ш) 4.36 к (ш)
(IV) Boc-G ly- Pro-OOde 1.40 (ш) 4.35 дд (ш) 4 : 1
1.43 (М) 4.50 дД(М)
(II) Z-Gly-Pro-OOde - 4.35 дд (гп) 9 : 1
4.50 дд (М)
(XI) Boc-Phe-Pro-Gly-OOde 1.37 (ш) 4.65 м 4: 1
1.40 (М)
(VI) Boc-Phe-Gly-Pro-OOde (10 мг/мл) 1.36 (М) 1.37 (ш) 4,95 м ушир. 9: I
(70 мг/мл) 1.34 5.0 м -
* Соответствующие дейтериймеченые соединения (III, V, VII, VIH, X, XII, XIII) имели те же спектральные характеристики.
PC MODEL (версия PI 3.2, Serena Software, PO Box 3076, Bloomington, IN, USA) также подтвердили, что в среде с диэлектрической проницаемостью хлороформа (е 5.1) энергетически более выгоден г^и с-кон форме р. Вероятно, именно остаток высшего алифатического спирта в виде окта-децилового эфира так заметно влияет на сдвиг подвижного цис-транс-ртпоъесня в сторону (реконфигурации имидной связи Х-Рго.
Интересно, что в 'Н-ЯМР-спектре Вос-Рго-Gly-OOde (IX) мы наблюдали только один синг-лет протонов Вос-группы в области 1.4
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.