Ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 2, с. 170-184
УДК 547.458.41.057
СИНТЕЗ ОЛИГОСАХАРИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ ВНУТРЕННИЙ И ТЕРМИНАЛЬНЫЙ ФРАГМЕНТ Galpl-3GkNAcp
© 2015 г. В. В. Северов*, Г. В. Пазынина**, Т. В. Овчинникова**, Н. В. Бовин**, #
*ФГБУН НИИ физико-химической медицины ФМБА России, 119435, Москва, М. Пироговская, 1а **ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 01.09.2014 г. Принята к печати 10.10.2014 г.
Синтезированы олигосахариды 0а1р1-301сМАсР^р, 01сМАср1-30а1р1-301сМАсР^р, Оаф1-3а1сМАср1-3аа1р1-3а1сМАсР-5р, аа1р1-301сМАср1-3аа1р1-4а1сМАсР-8р, 0а1р1-301сМАср1-60а1р1-401сМАсР^р (8р = 0(СН2)3МН2 или 0(СН2)2МН2). Гликозилирование осуществляли Ж-Тгос-защищенными производными глюкозамина или дисахарида Ьес.
Ключевые слова: синтез олигосахаридов, Тгос-защитная группа, Ьвс.
Б01: 10.7868/80132342315020128
ВВЕДЕНИЕ
Олиголактозаминовые и полилактозаминовые фрагменты — характерные элементы архитектуры комплексных Ж- и О-цепей гликопротеинов и некоторых гликолипидов [1, 2]. Одной из функций олиголактозаминов является специфическое взаимодействие с белками семейства галектинов [3]. Олигосахариды, содержащие фрагмент Ьес (Оа1р1-3С1сМАсР), в свободном виде присутствуют в женском молоке, являясь его обязательным компонентом [4]; однако те же олигосахариды в составе гликоконъюгатов клеток млекопитающих встречаются редко. В то же время, Ьес экспрессируется как антиген на поверхности клеток рака молочной железы [5]. Актуальность детального изучения углеводной специфичности галектинов обусловлена их участием во многих биологических процессах, например, они опосредуют клеточную адгезию, пролиферацию и апоптоз [6—9]. Углеводная специфичность определена только для нескольких галектинов из се-
мейства, насчитывающего 15 белков [10], некоторые из них связываются с Ьес-гликанами. Даже те из галектинов, в первую очередь галектины-1 и -3, которые изучены лучше других, также требуют дополнительных исследований, так как в опубликованных работах по их углеводной специфичности нет полного согласия. Для дальнейшего изучения галектинов необходимы новые молекулярные инструменты, гликоконъюгаты, которые в свою очередь синтезируют из олигосахаридов. Ранее мы сообщали о синтезе линейных и разветвленных олиголактозаминов [11, 12], в настоящей работе описан синтез Ьес-содержащих олигосахаридов, которые нашли применение для изучения галектинов, в том числе в составе нормальных и трансформированных клеток [13].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Целью данной работы был синтез следующей группы олигосахаридов (!)—(У):
Galp1-3GlcNAcp-O(CH2)3NH2 (I)
GlcNAcp1-3Galp1-3GlcNAcp-O(CH2)3NH2 (II)
Galp1-3GlcNAcp1-3Galp1-3GlcNAcp-O(CH2)3NH2 (III)
Galp1-3GlcNAcp1-3Galp1-4GlcNAcp-O(CH2)3NH2 (IV)
Galp1-3GlcNAcp1-6Galp1-4GlcNAcp-O(CH2)2NH2 (V)
Сокращения: Bn — бензил; Lec — Galp1-3GlcNAc; MS — масс-спектр; AgOTf — трифлат серебра; TMM — тетраметилмоче-вина; Troc — 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, TMSEt — Р-триметилсилилэтил. # Автор для переписки (тел.: +7 (495) 330-71-38; эл. почта: bovin@carb.ibch.ru).
OAc
OAc
OAc
AcO AcO
NHCOCF
OAc
NHAc
(XIII) (59%)
Troc :
Cl3C O
O
Л
i, j
Gaipi-3GlcNAcP-O(CH2)3NH2 (I) (96%)
Схема 1. a: AgOTf, TMM, MS-4 Â, CH2Cl2; b: MeONa, MeOH, CH2Cl2, 4°C; c: PhCH(OMe)2, TsOH, MeCN; d: 80% водн. AcOH, 80°C; e: Ac2O, Py; f CF3COOH, CH2Cl2; g: AcBr, MeOH, CH2Cl2, AcOH; h: AcOH, Ac2O, Zn, NEt3; i: MeONa/Me-OH; j: NaOH/H2O.
OHI
HO
OBn
OH
OH
OBn O
AcO
OBn
OBn
'O^\^NHCOCF3
a, b, c
NHAc HO
(XIV)
Схема 2. a: MeC(OEt)3, TsOH, MeCN; b: Ac2O/Py; c: 80% водн. AcOH.
OAc
NHAc (XV) (57%)
NHCOCF3
В нее входит Ье^дисахарид (I), его Р-(1-3)-производные с глюкозаминовым (II) и Ье^заме-стителем (III), а также тетрасахариды, в которых Lec является терминальным, а лактозамин коро-вым фрагментом со связью между ними Р-(1-3) (IV) и Р-(1-6) (V). Все эти олигосахариды содержат спейсерный агликон (sp = O(CH2)2NH2 или O(CH2)3NH2), позволяющий их использовать для получения неогликоконъюгатов, а также в чиповой технологии.
Ключевой стадией синтеза соединений (I)—(V) является гликозилирование при помощи N-три-хлорэтоксикарбонильного (Troc) [14] производного Lec (или глюкозамина в случае трисахарида (II)) методом Кенигса-Кнорра, который позволяет проводить реакцию стереонаправленно и с высоким выходом [15]. Следует также отметить, что превращение TrocNH-фрагмента в AcNH- не затрагивает другие защитные группы [14]. Ацетаты Troc-произ-водных гликозилбромидов в реакции Кенигса-Кнорра ранее уже успешно использовались нами для синтеза ряда олиголактозаминов и фрагментов О-цепей гликопротеинов [11, 12, 16, 17].
При синтезе Ье^гликозилдонора в качестве временной защиты аномерного центра использовали триметилсилилэтильную группу. Для этого глико-зилбромидом (VI), полученным из перацетата Troc-производного глюкозамина [18] действием бромистого водорода в уксусной кислоте, гликозилировали триметилсилилэтиловый спирт (схема 1) в присутствии трифлата серебра и тетраметилмочевины в хлористом метилене (соотношение донор/акцептор 1 : 1.3). В дальнейшем реакции гликозилирования проводили по этой же методике, варьируя соотношение донор/акцептор. Полученное производное (VII) выделяли хроматографией на силикагеле, выход
82%. Последовательным дезацетилированием ме-тилатом натрия и бензилиденированием действием диметокситолуола в присутствии толуолсульфокис-лоты получали производное (VIII) со свободной ОН-группой при С3 с выходом 71%. Гликозилирование соединения (VIII) гликозилбромидом (IX), полученным из перацетата галактозы, при соотношении донор/акцептор равным 1.5 : 1 приводило к образованию дисахарида (X) с выходом 75%. Удаление бензи-лиденовой защитной группы и последующее
ацетилирование диола давало производное Ьес (XI) с выходом 89%. Данные 1Н-ЯМР-спектра подтверждают образование Р-(1-3)-гликозидной связи: сигнал протона при С3а сдвинут в сильное поле (8 3.863 м.д.) по сравнению с ацетилированным по С3а соединением (VII) (8 5.086 м.д.) и величиной КССВ /1Ь2Ь 8.1 Гц. Далее ТМ8Е1-группу удаляли действием трифторуксусной кислоты в хлористом метилене, полученное 1-ОН производное ацетилировали и выделяли продукт (XII) с выходом 84%, а также его Р-аномер с выходом 7%. Основной а-аномер (XII) после кристаллизации был получен с выходом 72%.
Гликозилирование у-трифторацетамидопропано-ла гликозилбромидом Тгос-производного Ьес (ХНя), полученным из соответствующего ацетата (XII) (соотношение донор/акцептор 1 : 2), с последующей заменой Тгос-защиты на Л-ацетил действием цинка в смеси уксусной кислоты и уксусного ангидрида, привело к Р-аномеру (XIII) с суммарным выходом 59%, основной побочный продукт реакции гликози-лирования (предположительно а-аномер) не выделялся, его количество не превышало 5%. Конфигурация остатка глюкозамина подтверждается величиной КССВ, равной /1а2а 8.1 Гц. Его дезацетилированием и удалением Л-трифторацетильной защиты получен дисахарид (I) с выходом 96%.
Производное Ьес (XV) с одной ОН-группой при С3 галактозного остатка было синтезировано из ди-сахарида (XIV) [19] (схема 2) введением 3',4'-орто-эфирной защиты [20] триэтилортоацетатом в присутствии толуолсульфокислоты в ацетонитриле с последующим ацетилированием и раскрытием ор-тоэфирного цикла уксусной кислотой с суммарным выходом на три стадии 57%. О наличии свободной ОН-группы при С3Ь свидетельствует положение и мультиплетность сигнала протона при С3Ь в 1Н-ЯМР-спектре (8 3.772 м.д., /3ОН 5.9 Гц).
Гликозилирование производного Ьес (XV) с одной ОН-группой при С3 галактозного остатка двукратным избытком гликозилбромида Тгос-производного глюкозамина (VI) (схема 3) приве-
2
ло к трисахариду (XVI) (38%). При этом наблю-
1 Выходы везде даны для хроматографически выделенных соединений.
2 1
2 Полное отнесение 1Н-ЯМР-спектров продуктов в этой и последующих реакциях гликозилирования проводилось после замены Troc- и Bn-защит на N- и О-ацетильные, соответственно, так как их 1Н-ЯМР-спектры более информативны, легче интерпретируются и полностью характеризуют структуру полученных олигосахаридов.
далась неполная конверсия гликозилакцептора (XV) (40% возврата), основной побочный продукт реакции гликозилирования (предположительно а-аномер) не выделялся, его количество не превышало 10%. Действием цинка в смеси уксусной кислоты и уксусного ангидрида заменяли Тгое-защиту на Ж-ацетил и получали производное (XVII) (78%). Его гидрогенолиз с последую-
щим ацетилированием приводил к перацетату трисахарида (XVIII) (83%). Данные 1Н-ЯМР-спектра подтверждают образование Р-(1-3)-гликозидной связи (8 3.952 м.д. для С3Ь, /1с2с 8.0 Гц). После дезацетилирования и удаления Ж-трифторацетильной защиты был получен целевой трисахарид (II) (91%).
(XV)
ОВп
КИАс
ОАс
е, I
а
а1еМАер1-3аа1р1-3а1еМАев-0(СН2)3МН2 (II) (91%) Схема 3. а: Ag0Tf, ТММ, М8-4 А, СН2С12; Ь: АеОН, Ае20, Хп, ^Ц; с: 10% Pd/C, Н2, МеОН; ± Ае20/Ру; е: Ме0№/Ме0Н; I: №0Н/Н20.
Гликозилированием производного (XV) глико-зилбромидом Тгое-производного Ьее (XПa) при двукратном избытке донора по отношению к акцептору (схема 4), был получен олигосахарид ^Щ) (30%) и его аномер ^ГСа) (35%) при 30%-м возврате исходного дисахарида (XV). Далее проводили замену Тгое-защиты на Ж-ацетил, выход продукта (XXP) составил 64%. Его гидрогено-лизом е последующим ацетилированием был получен перацетат тетрасахарида (XXIP) (75%). Данные хН-ЯМР-спектра подтверждают образование Р-(1-3)-гликозидной связи (8 3.89—3.95 м.д. для
сигнала протона при С3Ь, /1е 2е ~ 8 Гц). Удаление защитных групп привело к аминопропилглико-зиду (III) с выходом 95%.
Аналогично из олигосахарида (XIXа), заменой Тгое-защиты на Ж-ацетил с выходом 48% был получен тетрасахарид (XXa), гидрогенолиз и последующее ацетилирование которого привели к перацетату (XXIa) с выходом 66% (8 3.96—4.06 м.д. для сигнала протона при С3Ь, /1е, 2е 3.4 Гц). Удаление защитных групп привело к аминопропильному производному (Ша) с выходом 88%.
(ХПя) (XV)
0а1р1-301сМЛср1-30а1р1-301сМЛср-0(СН2)3МН2 (III) (
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.