ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ. Серия Б, 2015, том 57, № 4, с. 281-294
СИНТЕЗ
УДК 541.64:544.23
СИНТЕЗ ПОЛИ(МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ) И ФОРМИРОВАНИЕ НА ЕЕ ОСНОВЕ СУПЕРПОРИСТЫХ БИОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ1 © 2015 г. И. В. Аверьянов*, В. А. Коржиков*, **, Т. Б. Тенникова*, **
*Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук 199004 Санкт-Петербург, Большой пр., 31 ** Институт химии Санкт-Петребургского государственного университета 198504 Петергоф, Университетский пр., 26 Поступила в редакцию 21.01.2015 г. Принята в печать 02.04.2015 г.
Описан многостадийный метод создания биодеградируемых матриксов (скаффолдов), поддерживающих рост клеток и планируемых к использованию в тканевой инженерии. Приведены и обсуждены результаты исследования синтеза поли(молочной кислоты) и ее свойств, а также обсуждена стратегия формирования суперпористых биодеградируемых материалов с поверхностью, модифицированной биологическими лигандами.
БО1: 10.7868/82308113915040014
Известно, что биодеградируемые полимеры занимают значимое место в различных биомедицинских областях, в частности, в тканевой инженерии [1, 2]. Эта отрасль современной биотехнологии представляет собой междисциплинарное направление, предметом которого является выращивание из клеток пациента живых тканей, а в перспективе — органов, предназначенных для так называемой регенеративной медицины [3]. С развитием тканевой инженерии возникла необходимость в разработке специальных сред, скаффолдов, или каркасов, в которых имеет место прикрепление клеток, стимулирование их пролиферации, дифференциации и трехмерного роста клеточной массы, что в конечном счете приводит к образованию жизнеспособной ткани. Один из перспективных разделов данной биотехнологической отрасли — инженерия костной ткани [4]. Скаффолды для инженерии костной ткани должны удовлетворять целому комплексу требований, самими значимыми из которых являются способность к биодеградации, суперпористая структура, механическая прочность, а также биологическая функциональность (т.е. способность влиять на поведение клеток) [5, 6].
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект 14-13-00940) и, частично, гранта Санкт-Петербургского государственного университета на проведение фундаментальных исследований (0.37.682.2013).
E-mail: v_korzhikov@mail.ru (Коржиков Виктор Александрович).
В качестве материала для создания клеточных носителей наибольшую перспективу имеют полимеры с известными характеристиками, такими как биологическая совместимость (низкая токсичность, низкая иммуногенность и т.д.). Среди наиболее изученных и широко используемых представителей таких макромолекулярных продуктов — полимолочная кислота (ПМК) [7, 8]. Интерес, проявляемый к этому типу макромолекул, обусловлен прежде всего их способностью к биодеградации и выведению из организма продуктов распада естественными метаболическими путями. Несмотря на значительное количество работ, посвященных созданию скаффолдов на основе ПМК [9—14], ни один материал, удовлетворяющий перечисленным требованиям, не достиг стадии клинических исследований. На взгляд авторов настоящей работы, данное обстоятельство связано в первую очередь с раздробленностью исследований, посвященных синтезу полимера, получению материалов на его основе, а также приданию этим материалам биологических свойств.
В качестве метода синтеза ПМК в настоящее время наиболее часто используют метод цепной полимеризации лактида с раскрытием цикла [15, 16]. В работах [17, 18] установлены кинетические закономерности образования полимера в присутствии октоата олова. Также описаны различные инициирующие системы, позволяющие минимизировать молекулярно-массовое распределение полимерного продукта при проведении полимеризации в массе мономера [19, 20] и в растворе
[21, 22]. Тем не менее, исследования, направленные на синтез полимеров со свойствами, необходимыми для создания скаффолдов, в литературе встречаются достаточно редко.
Для формирования суперпористых матриксов на основе ПМК могут быть использованы различные методы: электроспининг [23, 24], вымывание солей [25], трехмерная печать [26], термически индуцированное разделение фаз [27, 28]. Все перечисленные методы позволяют получать пористые материалы, однако только последний обеспечивает возможность варьирования морфологии матриксов в широких пределах без использования сложных инструментов. Отметим, что во всех указанных исследованиях описано использование коммерческих полимеров, а, значит, не раскрывается взаимосвязь между условиями синтеза, структурой полимера и морфологией получаемых матриксов.
В настоящее время становится все более очевидным, что суперпористые носители клеток не могут самостоятельно стимулировать адгезию, рост и дифференциацию клеток [14]. Для образования новой ткани необходимо введение в структуру поверхности скаффолда специальных биомолекул, способных контролировать взаимодействие биоматериал—клетка [29]. Исследования в данном направлении ограничены физической адсорбцией биомолекул на поверхности пористых матриксов [30], а также использованием ионизованной плазмы с целью гидрофилизации поверхности и создания реакционноспособных групп [31]. Адсорбция белков во многих случаях не является адекватным методом биологической функционализации материала из-за низкой прочности нековалентных связей, удерживающих биомолекулу на поверхности носителя, а также падения активности белков, вызванного взаимодействием с относительно гидрофобной поверхностью ПМК. Обработка плазмой дает интересные результаты, но требует использования специального оборудования, что затрудняет широкое применение данного метода. Подчеркнем, что большинство исследований по модификации поверхности проводилось на пленках полимолочной кислоты [32, 33]. В связи с этим влияние способа модификации на поровую структуру материала практически не изучено. Таким образом, разработка новых и простых методов ковалент-ной модификации поверхности суперпористых матриксов на основе ПМК представляет актуальную задачу.
Как уже было отмечене выше, в цитируемых исследованиях акцент делали либо на синтезе полимеров, либо на разработке материалов на основе готового полимера, что исключало предложение комплексного подхода к созданию сложноор-ганизованных структур. В настоящей работе авторы демонстрируют весь путь получения
скаффолда — от синтеза полимеров, до формирования контролируемой поровой структуры материала и предложения методов его биофункциона-лизации путем химической модификации поверхности.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Органические растворители (толуол, хлороформ, гексан, тетрагидрофуран, метанол) были приобретены в Закрытом акционерном обществе "Вектон". Толуол и тетрагидрофуран, применяемые для перекристаллизации лактида и в качестве элюента для гель-проникающей хроматографии соответственно обезвоживали над гидридом кальция и очищали перегонкой. Инициатор полимеризации октоат олова, а также растворитель 1,4-диоксан, необходимый для получения пористых матриксов ("81§та-АЫг1сИ") использовали без дополнительной очистки. Ь-лактид и D,L-лактид ("81§та-АЫг1сИ") перед каждым синтезом подвергали перекристаллизации из сухого толуола. Наночастицы гидроксилапатита (по данным просвечивающей электронной микроскопии: 10 нм, иглы с соотношением длина : толщина, равным трем) были предоставлены О.М. Осмоловской (группа синтеза и исследования наночастиц и на-ноструктурированных материалов Института химии Санкт-Петербургского государственного университета).
Синтез полимолочной кислоты
В пробирку Шленка объемом 25 мл помещали 15.0 г (104.0 ммоль) лактида и несколько минут вакуумировали с использованием масляного насоса (2НВР-0.1Д). В токе аргона добавляли раствор октоата олова, растворенного в 100 мкл сухого толуола. Реакцию проводили при умеренном перемешивании на магнитной мешалке в вакууме (~10-2 мм рт. ст.) при температуре 130°С (табл. 1). По завершении полимеризации смесь охлаждали до комнатной температуры, содержимое пробирки растворяли в хлороформе, полученный раствор концентрировали в вакууме и осаждали в холодный метанол. Осадок отделяли фильтрацией и сушили в вакууме. Выход продукта реакции и мо-лекулярно-массовые характеристики приведены в табл. 1.
Молекулярно-массовые характеристики полимеров
Характеристическую вязкость определяли с помощью капиллярного вискозиметра Оствальда ВПЖ-4 (Закрытое акционерное общество "Нева-Реактив") с диаметром капилляра 0.37 мм. Для установления молекулярных масс и молекуляр-но-массового распределения использовали жид-
Таблица 1. Полимеризация лактида и характеристики полученных полимеров (полимеризация в массе мономера, в вакууме (10-2 мм рт. ст.), Т = 130 ± 5°С)
Образец Условия реакции Выход, % Характеристики полимера
[мономер] : [SnOct2], моль/моль время, ч [п] (диоксан, 25°С), дл/г Mw х 10-3 (ГПХ) Mw /мп
L-лактид
1 550 2.5 45 0.08 5 1.8
2 1000 3.0 59 0.19 11 1.9
3 2000 4.0 96 0.25 17 2.1
4 10000 6.0 85 ЮО 140 Ю
D,L^aKT^;
5 680 1.5 30 0Л1 7 2.0
6 2500 3.0 98 0.78 148 1.8
7 2500 24.0 94 0.45 45 2.4
8 5000 4.0 70 0.94 250 1.5
костной хроматограф фирмы "Shimadzu" с рефрактометрическим детектором RID-10A, контроллером SCL-10A и колонкой Waters Styragel HMW 6E (8 х 300 мм). Элюентом служил ТГФ. Объем пробы во всех случаях составлял 10 мкл, скорость потока 0.3 мл/мин. Для обработки полученных кривых элюирования применяли программное обеспечение LC Solution 1.24SP1 GPC ("Shimadzu").
Степень кристалличности полимеров и механические характеристики матриксов
Измерения методом дифференциальной сканирующей калориметрии выполняли на калориметре "NETZSCH DSC 204F1" в диапазоне - 80 ... +200°С со скоростью нагревания 10 град/мин. Динамический модуль упругости на сжатие образцов в высушенном состоянии определяли на установке DMA 242 C фирмы "NETZSCH" на частоте 1 Гц при температуре 20°С. Рентгенограммы полимеров снимали на дифрактометре "Bruker D2 Phaser".
Биодеградация пленок
Методом формования расплава синтезированных полимеров получали пленки толщиной 100 мкм. Образцы площад
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.