научная статья по теме СИНТЕЗ Р1-[11-(АНТРАЦЕН-9-ИЛМЕТОКСИ)УНДЕЦИЛ]-Р2-(2-АЦЕТАМИДО-2-ДЕЗОКСИ- -D-ГЛЮКОПИРАНОЗИЛ)ДИФОСФАТА И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО АКЦЕПТОРНЫХ СВОЙСТВ В ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ, КАТАЛИЗИРУЕМОЙ D-РАМНОЗИЛТРАНСФЕРАЗОЙ ИЗ КЛЕТОК PSEUDOMONAS AERUGINOSA Химия

Ш БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 1, с. 121-123

ПИСЬМА РЕДАКТОРУ

УДК 547.914.4118.057

СИНТЕЗ Р1-[11-(АНТРАЦЕН-9-ИЛМЕТОКСИ)УНДЕЦИЛ]-Р2-(2-АЦЕТАМИД0-2-ДЕЗ0КСИ-а-0-ГЛЮК0ПИРАН0ЗИЛ)ДИФ0СФАТА И ИССЛЕД0ВАНИЕ ЕГ0 АКЦЕПТОРНЫХ СВ0ЙСТВ В ФЕРМЕНТАТИВН0Й РЕАКЦИИ, КАТАЛИЗИРУЕМ0Й 0-РАМН0ЗИЛТРАНСФЕРАЗ0Й ИЗ КЛЕТ0К PSEUDOMONAS AERUGINOSA © 2015 г. А. Н. Винникова*, В. И. Торгов*, Н. С. Уткина*, #, В. В. Веселовский*,

Т. Н. Дружинина*, S. Wang**, I. Brockhausen** , Л. Л. Данилов*

*ФГБУНИнститут органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, 119991, Москва, Ленинский пр., 47 **Department of Medicine and Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University,

Kingston, Ontario, Canada K7L 3N6 Поступила в редакцию 04.08.2014 г. Принята к печати 12.08.2014 г.

Синтезировано флуоресцентное производное ундецилдифосфат-2-ацетамидо-2-дезоксиглюкозы: Р1-[11-(антрацен-9-илметокси)ундецил]- Р2 -(2-ацетамидо-2-дезокси-а^-глюкопиранозил)дифос-фат. Показана способность этого соединения служить субстратом-акцептором остатка D-рамнозы в ферментативной реакции, катализируемой D-рамнозилтрансферазой WbpZ из клеток Pseudomonas aeruginosa PAO1.

Ключевые слова: Р1-[11-(антрацен-9-илметокси)ундецил]-Р2-(2-ацетамидо-2-дезокси-а-D-глюкопирано-зил)дифосфат, флуоресцентный субстрат, D-рамнозилтрансфераза, Pseudomonas aeruginosa PAO1.

DOI: 10.7868/S0132342315010157

Ранее нами было показано, что при исследовании процесса биосинтеза О-антигенных полисахаридов бактерий рода Salmonella и Escherichia coli природный субстрат-акцептор (ундекапренилди-фосфатсахар) может быть заменен синтетическим аналогом, содержащим нефлуоресцентную или флуоресцентную липофильную группу. Подобная замена позволяет значительно повысить чувствительность детектирования продуктов ферментативных реакций, особенно в случае флуоресцентно-меченных соединений [1—9]. Бактерии Pseudomonas aeruginosa являются важными оппортунистическими патогенами, содержащими полимер D-рамнозы в качестве общего О-антигена. Недавно было найдено, что D-рамнозилтрансфераза (WbpZ) из клеток P. aeruginosa PAO1 способна переносить остаток D-рамнозы на феноксиундецил-дифосфат-2-ацетамидо-2-дезоксиглюкозу [10].

В настоящем сообщении мы описываем синтез нового флуоресцентного соединения: Р1-[11-(ан-трацен-9-илметокси)ундецил] -Р2-(2-ацетамидо-2-дезокси-а^-глюкопиранозил)дифосфата (V), из 11-(антрацен-9-илметокси)ундецилфосфата (I) и 2-ацетамидо-2-дезокси-3,4,6-три-О-ацетил-а^-глюкопиранозилфосфата (III). Нами показано,

#Автор для связи (тел.: +7-499-137-75-70, эл. почта: utkin-ans@yahoo.com).

что полученное соединение способно служить субстратом-акцептором для О-рамнозилтрансферазы (WbpZ), катализирующей вторую стадию сборки общего антигена P. aeruginosa PAO1, которая переносит остаток D-Rha от GDP-D-Rha на акцептор (V).

Целевой дифосфат (V) синтезировали разработанным нами ранее фосфоимидазолидным методом [11], аналогично протоколу, описанному в работе [6] (схема). Для этого 11-(антрацен-9-илметок-си)ундецилфосфат (I), полученный в четыре стадии из ундец-10-ен-1-ола [6, 8], переводили в диизопро-пиламмониевую соль обработкой избытком диизо-пропиламина в абс. бензоле и лиофильно высушивали. Полученную соль превращали в фосфоими-дазолид (II) реакцией с ^,^-карбонил-диимидазолом (CDI) в абс. THF (20°С, 1.5 ч, аргон) с последующим разложением избытка активирующего агента метанолом и удалением растворителей. К остатку, растворенному в абс. THF, прибавляли 1.4 моль-экв. диизопропиламмоние-вой соли 2-ацетамидо-2-дезокси-3,4,6-три-О-ацетил-а-О-глюкопиранозилфосфата (III) [1]. Реакционную смесь перемешивали (37°С, 96 ч, аргон), растворители удаляли без нагревания. Для определения физико-химических характеристик защищенного продукта реакции небольшую порцию реакционной смеси хроматографировали на колонке с сефадексом G-15, используя 0.1% раствор

122

ВИННИКОВА и др.

О

о

си)

OR

RO' RO

O

O

O

Y

O

NHO-p-o-p-O'

I

О-

I

О-

OPO3H

3H2

(I)

1. Pr2NH

2. CDI

. O /-n

O-

OAc

AcO^^X АсОЛ-^Г^Л

(III) \^NHopo2-O

O

(IV) R = Ac (V) R = H

Схема.

a

MeONa

NH4HCO3 в метаноле в качестве элюента и контролируя элюцию с помощью ТСХ. Очищенное таким образом соединение (IV) имело R 0.34 (Silica Gel 60 F254) в системе хлороформ—метанол—вода, 60 : 25 : 4. Спектр ^-ЯМР (600.13 МГц, CD3OD) 8, м.д., J, Гц: 8.45 (1Н, с, аром. Н), 8.33 (2Н, д, J 8.4, аром. Н), 7.99 (2Н, д, J 8.4, аром. Н), 7.52 (2Н, т, J 7.2, аром. Н), 7.45 (2Н, т, J 7.2, аром. Н), 5.57 (1Н, уш. д, Н1), 5.44 (2Н, с, ОСН2ЛШ), 5.29 (1Н, т, J43 9.6, Н4), 5.13 (1Н, т, J34 9.6, Н3), 4.394.29 (3Н, м, Н2, Н5 и Н6), 4.16 (1Н, м, Н6'), 3.96 (2Н, м, CH2OP), 3.68 (2Н, т, J6.6, Н2С(11)), 2.15, 2.05, 2.02 и 1.97 (12Н, 4с, 4COCH3), 1.63-1.59 (4Н, м, Н2С(10) и Н2(С3)), 1.31-1.21 (14Н, м, 7СН2). Спектр 13С-ЯМР (150.9 МГц, CD3OD): 131.78, 129.44, 128.97, 126.85, 125.64, 95.36, 72.54, 71.46, 69.35, 69.22, 66.97, 65.53, 62.44, 31.36, 30.29, 30.14, 30.03, 26.82, 26.48, 22.69, 20.75, 19.35. Спектр 31Р-ЯМР (242.93 МГц, CD3OD): -10.4 (уш.д, Р2), -13.3 (уш. д, Р1). Масс-спектр ESI высокого разрешения найдено: m/z 866.2921; вычислено для C40H54NO16P2, [M—H]-: 866.2923.

Основную часть продукта реакции без предварительной очистки дезацетилировали действием раствора NaOMe в метаноле (20°С, 2 ч) с последующей нейтрализацией конц. AcOH. После удаления растворителя и растворения остатка в воде целевой Р1-[11-(антрацен-9-илметокси)ун-

децил]-Р2-(2-ацетамидо-2-дезокси-а-^-глюко-пиранозил)дифосфат (V) выделяли на картриджах Sep-Pak C18 (Waters, США), нанося на них небольшие порции раствора и элюируя ступенчатым градиентом от воды до метанола с контролем по ТСХ (выход 20%, Rf 0.52 в системе хлороформ-метанол—вода, 10 : 10 : 3). Спектр 1Н-ЯМР (CD3OD): 8.51 (1Н, с, аром. Н), 8.40 (2Н, д, J 8.4, аром. Н), 8.05 (2Н, д, J 8.4, аром. Н), 7.55 (2Н, т, J7.8, аром. Н), 7.48 (2Н, т, J 7.8, аром. Н), 5.55 (1Н, уш.д, Н1), 5.49 (2Н, с, ОСН2ЛпО, 3.98 (4Н, м, СН2ОР, Н2 и H5), 3.89 (1Н, д, J 11.4, Н6'), 3.77 (1Н, т, J9.0, H3), 3.70 (2Н, т, J6.6, Н2С(11)), 3.67-3.65 (1Н, м, Н6), 3.38-3.34 (1Н, м, Н4), 2.06 (1Н, с, COCH3), 1.65-1.58 (4Н, м, Н2С(10) и Н2С(3)), 1.321.29 (14Н, м, 7СН2). Спектр 13С-ЯМР ^D3OD): 130.20, 129.48, 127.34, 126.21, 125.58, 96.41, 75.11, 73.24, 72.42, 71.75, 67.45, 65.87, 63.12, 60.45, 56.85, 55.62, 34.65, 32.01, 30.91, 30.80, 27.65, 27.08, 23.67, 19.90. Спектр 31Р-ЯМР (CD3OD): -10.3 (уш. д, Р1), —12.4 (уш д, Р2). Масс-спектр ESI высокого разрешения найдено: m/z 808.2203, вычислено для G34H47NO13P2Na3, [M-2H + 3Na]+: 808.2210. УФ-спектр и спектр флуоресценции (H2O): ^max, нм (s): 247 (46400); ^возб 247 нм, 415 нм.

Способность Р1-[11-(антрацен-9-илметокси)ун-децил]-Р2-(2-ацетамидо-2-дезокси-а-^-глюкопи-ранозил)дифосфата (V) присоединять остаток ^-рамнозы от GDP-^-Rha с образованием ^-Rha-

СИНТЕЗ Р1-[11-(АНТРАЦЕН-9-ИЛМЕТОКСИ)УНДЕЦИЛ]-Р2-(2-АЦЕТАМИДО-2

123

Z>-GlcNAca1-PP-(CH2)1rOCH2Ant в ферментативной реакции, катализируемой ^-рамнозил-трансферазой (WbpZ) из клеток P. aeruginosa PAO1, определялась аналогично протоколу, описанному для Р1-(11-феноксиундецил)-Р2-(2-ацетамидо-2-дезокси-а-^-глюкопиранозил)ди-фосфата [10]. Было показано, что эффективность содержащего антраценилметоксигруппу соединения (V) в качестве субстрата-акцептора составляет 57% по сравнению с аналогом, содержащим фе-ноксигруппу. Субстраты-акцепторы и продукты ферментативных реакций могут быть разделены с помощью офВЭЖХ и количественно определены с помощью измерения флуоресценции. Присутствие флуорофорной группы в молекуле акцептора позволяло обойтись без применения радиоактивного нуклеозиддифосфатсахара для высокочувствительного детектирования продукта ферментной реакции. Фермент был вполне толерантен к объемной антраценильной группе, а наличие флуорофора значительно повышало чувствительность детектирования в процессе идентификации и выделения продукта ферментативной реакции.

Таким образом, нами синтезирована не описанная ранее антрацен-9-илметоксиундецилди-фосфат-2-ацетамидо-2-дезоксиглюкоза, содержащая флуорофор, и продемонстрирована ее способность служить субстратом-акцептором .D-рамнозилтрансферазы (WbpZ) из P. aeruginosa PAO1.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект № 13-0400358). Авторы благодарны д.х.н. А.С. Шашкову

за регистрацию спектров ЯМР и помощь в их интерпретации.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Montoya-Peleaz P.J., Riley J.G., Szarek W.A., Valvano M.A., Schutzbach J.S., Brockhausen I. // Bioorgan. Med. Chem. Lett. 2005. V. 15. P. 1205-1211.

2. Данилов Л.Л., Веселовский В. В., Балагурова Н.М., Дружинина Т.Н. // Биоорган. химия. 2009. Т. 35. С. 431-432.

3. Druzhinina T.N., Danilov L.L., Torgov V.I., Utkina N.S., Balagurova N.M., Veselovsky V.V., Chizhov A.O. // Car-bohydr. Res. 2010. V. 345. P. 2636-2640.

4. Уткина Н.С., Данилов Л.Л., Дружинина Т.Н., Веселовский В.В. // Биоорган. химия. 2010. V 36. P 853- 855.

5. Уткина Н.С., Данилов Л.Л., Веселовский В.В., Торгов В.И., Дружинина Т.Н. // Биоорган. химия.

2012. Т. 38. С. 472-476.

6. Винникова А.Н., Уткина Н.С., Данилов Л., Торгов В.И., Дружинина Т.Н., Веселовский В.В. // Биоорган. химия. 2013. Т. 39. С. 1-6.

7. Gao Y, Liu B., Strum S., Schutzbach J, Druzhinina T.N., Utkina N.S., Torgov V.I., Danilov L.L., Veselovsky V.V., Vlahakis J.Z., Szarek W.A., WangL, Brockhausen I. // Glycobiology. 2012. V. 22. P. 1092-1102.

8. Vinnikova A.N., Druzhinina T.N., Danilov L.L., Utkina N.S., Torgov V.I., Veselovsky V.V., Wang S., Liu B., Wang L., Brockhausen I. // Cardohydr. Res.

2013. V 366. P. 17-24.

9. Данилов Л.Л., Балагурова Н.М., Винникова А.Н., Уткина Н.С., Торгов В.И., Калинчук Н.А., Дружинина Т.Н., Веселовский В.В. // Биоорган. химия. 2014. Т. 40, С. 99-107.

10. Wang S., Tanaka H., Hindsgaul O., Lam J.S., Brockhausen I. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2013. V. 366. P. 3491-3495.

11. Danilov L.L., Maltsev S.D., Shibaev V.N., Kochet-kov N.K. // Carbohydr. Res. 1981. V. 88. P. 203-211.

1 2 The Synthesis of P-[11-(Anthracen-9-ylmethoxy)undecyl]-P2-(2-Acetamido-2-

deoxy-a-Ö-Glucopyranosyl)

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.