МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 5, с. 798-803
= ДНК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
УДК 577.1
СИНТЕЗ РНК ПОСРЕДСТВОМ УДЛИНЕНИЯ ПРАЙМЕРА ПРИ ПОМОЩИ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ФАГА Т7
© 2004 г. С. Ä. Иванов1' 2, R. Welz1, М. Б. Готтих2, S. Müller1*
1Рурский университет, химический факультет, Бохум, 44780, Германия 2Химический факультет и Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992
Поступила в редакцию 19.01.2004 г.
Транскрипция на синтетических ДНК-матрицах при помощи РНК-полимеразы фага Т7 представляет собой один из наиболее общих методов синтеза протяженных молекул РНК. Однако ферментативный подход не позволяет направленно вводить модифицированные нуклеотиды в цепь РНК. Применение химического синтеза позволяет решить подобную задачу, но при этом длина синтезированного полирибонуклеотида не может быть более 80 звеньев. Мы совместили химический и ферментативный подход для синтеза молекулы РНК методом удлинения РНК-праймера при помощи РНК-полимеразы фага Т7. Синтезированный химическим путем РНК-праймер, содержащий флуоресцеин на 5'-конце, удлиняли ферментативно, при этом в качестве матрицы использовали од-ноцепочечную молекулу ДНК. Показано, что РНК-полимераза фага Т7 способна удлинять РНК-праймер с образованием полноразмерного РНК-продукта. Синтезированная 34-звенная РНК является субстратом для двойного рибозима, который расщепляет ее в ожидаемых позициях.
Ключевые слова: удлинение праймера; синтез РНК; транскрипция; РНК-полимераза фага Т7.
RNA SYNTHESIS BY T7 RNA POLYMERASE SUPPORTED PRIMER EXTENSION, by S. A. Ivanov1,2, R. Welz1, M. B. Gottikh2, S. Müller2* ^Ruhr-Universität Bochum, Fakultät für Chemie, 44780 Bochum, Germany; *E-mail: sabine.mueller@orch.ruhr-uni-bochum.de; 2 Department of Chemistry and Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Moscow State University, 119992 Moscow, Russia). Transcription of RNA molecules from synthetic DNA templates with T7 RNA polymerase is a common procedure for the preparation of long RNA molecules. However, enzymatic synthesis does not allow for site-specific incorporation of modified nucleotides. RNA synthesis by chemical methods on the other side can satisfy this purpose, but it is limited to RNA fragments of about 80 nucleotides at maximum. We aimed to combine both chemical and enzymatic procedures to synthesise RNA molecules by RNA primed transcription with T7 RNA polymerase. To this end we have chemically synthesised a fluorescein labelled RNA primer and studied elongation of this primer by T7 RNA polymerase on a single-stranded DNA template. We show that the enzyme is capable of extending the primer to the full-length product. The 34-mer rNa that has been synthesised by RNA primed transcription served as substrate for a twin ribozyme and was successfully cleaved in the expected manner.
Большинство прокариотических и эукариоти-ческих ДНК-зависимых РНК-полимераз состоят из нескольких субъединиц и осуществляют синтез матричной РНК, механизм которого достаточно сложен [1, 2]. РНК-полимераза бактериофага Т7 (далее - РНК-полимераза) представляет собой относительно простой по строению фермент (99 кДа) и транскрибирует полностью ДНК бактериофага. Эта полимераза используется как модельный фермент при изучении механизма действия ДНК-зависимых РНК-полимераз. Транскрипция начинается с присоединения РНК-полимеразы к промоторному участку ДНК [3]. При этом происходит расплетание двуцепочеч-ной ДНК, и образующийся в результате этого в
* Эл. почта: sabine.mueller@orch.ruhr-uni-bochum.de
позициях +1 и +2 участок одноцепочечной ДНК-матрицы может взаимодействовать с комплементарными рибонуклеозидтрифосфатами. На начальной стадии транскрипции полимераза многократно синтезирует короткие фрагменты РНК, которые легко диссоциируют из комплекса матрица • полимераза [4]. Эта стадия транскрипции называется абортивной инициацией. После того как длина РНК-транскрипта достигает 8-10 нук-леотидов, фермент претерпевает конформацион-ные изменения, в результате которых образуется прочный элонгационный комплекс. Транскрипция переходит в продуктивную стадию [5]. Синтез РНК происходит до тех пор, пока РНК-полимераза не достигнет терминаторной последовательности или конца матрицы.
Большое внимание уделяется взаимодействию полимеразы с ДНК-матрицей и синтезируемой цепью РНК на стадиях инициации, элонгации и терминации. Обнаружено, что на стадии абортивной инициации транскрипции матричная цепь ДНК "сминается" в полости фермента вблизи активного центра РНК-полимеразы фага Т7 [6]. Прежде, чем короткие транскрипты диссоциируют от матрицы, их длина должна достичь трех нуклеотидов. Переход от абортивной инициации к продуктивной транскрипции происходит тогда, когда полость фермента вблизи активного центра более не способна вмещать матричную цепь [6]. Промоторный участок ДНК высвобождается из фермента, и транскрипт прочно связывается с К-концевым доменом полимеразы [7]. Переход от стадии инициации к стадии элонгации сопровождается значительными конформационными изменениями в этом домене. В ходе них изменяется структура участка фермента, отвечающего за связывание с промотором, и создаются два канала: один - вблизи активного центра, в котором находится гетеродуплекс, и второй - выводящий синтезированную цепь РНК-транскрипта. Эти конформационные изменения способствуют переходу транскрипции в стадию продуктивной элонгации РНК [8].
Механизм перехода от инициации к элонгации и его структурные основы изучали на большом числе модельных систем, воспроизводящих элон-гационный комплекс и основанных на использовании синтетических олигонуклеотидов [9-11]. Давно известно, что РНК-полимеразы фагов способны удлинять короткие олигорибонуклеотиды, комплементарные промоторному участку ДНК-матрицы [12, 13]. В частности, РНК в составе синтетических РНК • ДНК-дуплексов, имеющих в структуре "выпетленные" участки и имитирующих структуру нуклеиновой кислоты в элонгаци-онном комплексе, можно удлинить при помощи РНК-полимеразы с образованием полноразмерного продукта [9, 10]. Даубе и Хиппель [9] осуществили продуктивный синтез РНК, используя ге-теродуплексы с "выпетливаниями" различной длины. Более поздние исследования показали, что РНК-полимеразы способны удлинять прай-меры и в комплексе с ДНК-матрицами, не содержащими промоторных участков [14, 15]. Однако в этом случае эффективность транскрипции была ниже, чем в дуплексах с "выпетливанием", описанных выше. На основании данных, полученных при изучении модельных систем, сделано предположение, что структура в виде "выпетливания", образуемая цепью ДНК вокруг РНК-праймера на стадии инициации транскрипции, является одним из необходимых факторов, приводящих к кон-формационным изменениям структуры РНК-полимеразы и, как следствие, к образованию проч-
ного и продуктивного элонгационного комплекса [9].
Удлинение РНК-праймеров при помощи РНК-полимеразы фага Т7 открывает возможность для синтеза протяженных молекул РНК с различными модификациями в определенных положениях. Участок РНК, содержащий модифицированный фрагмент, может быть синтезирован химическим путем и использован в качестве праймера, который впоследствии может быть удлинен фермен-тативно на соответствующей ДНК-матрице. Химический синтез позволяет получать олигорибонуклеотиды, содержащие разнообразные модификации. Несмотря на то, что химическим путем можно синтезировать молекулы РНК длиной около 80 звеньев, часто стоит задача синтеза еще более протяженных РНК, содержащих модифицированные участки. Комбинация химического и ферментативного подходов позволяет решить такую задачу. На пути к этому мы исследовали способность РНК-полимеразы фага Т7 удлинять модифицированный РНК-праймер с использованием в качестве матрицы одноцепочечной ДНК. Предложенный нами метод позволяет удлинять РНК-праймер на ДНК-матрице в препаративном масштабе. В качестве модельного олигонуклео-тида синтезировали биологически активную 34-звенную РНК, которая является субстратом для двойного рибозима.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Синтез праймера S-Seq. 1A. РНК-праймер синтезировали с помощью амидофосфитного фос-фотриэфирного метода, метили флуоресцентным красителем по 5'-концу на автоматическом синтезаторе (Gene Assembler Special, "Pharmacia") и очищали по описанным методам [16, 17]. ДНК-матрица Siv-Temp.1 приобретена на фирме "BioTez" (Германия).
Удлинение праймера при помощи РНК-поли-меразы. Формирование дуплекса между матрицей ДНК и РНК-праймером (200 нМ) проводили в обычном транскрипционном буфере для РНК-полимеразы фага Т7 (40 мМ Трис-HCl, pH 7.9, 6 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ, 10 мМ NaCl, 2 мМ спермидин) путем нагревания смеси до 80°C и медленного (1.5 ч) охлаждения до комнатной температуры. Реакцию удлинения праймера вели при 37°C с использованием РНК-полимерзы (МВ1 "Fermentas") и рибонуклеозидтрифосфатов ("Amersham Pharmacia Biotech"). Концентрация фермента в реакционной смеси - 10 ед./мкл, трифосфатов - 2 мМ. Аликвоты (3 мкл) реакционной смеси отбирали через 10, 20, 40, 60, 120 и 180 мин, останавливая реакцию путем добавления 6 мкл "стоп-раствора" (10 мМ EDTA в 98% водном растворе формамида) во льду. Реакционные смеси фракционировали в 15%-ном денатурирующем (7 М мочевина) поли-
Б^. 1А 5'-Ф- г(иОАС АОи С С А ОА А А)-3' 14-мер
81у-Тешр.1 3'-d(AcTОTcAoОтCтTTAОAОООAОTОTCAООAОAAA)-5' 34-мер
Рис. 1. Использованная в работе система олигонуклеотидов. Полноразмерный РНК-продукт является субстратом для двойного рибозима [19].
акриламидном геле (ПААГ) с помощью электрофореза на ДНК-секвенаторе (A.L.F. DNA sequencer, "Amersham Pharmacia Biotech") [16]. Данные обрабатывали, используя программу "DNA Fragment Analyser 1. 2" той же фирмы.
Реакцию удлинения праймера в препаративном масштабе проводили в стандартном буфере при концентрации РНК • ДНК-дуплекса 5 мкМ, РНК-полимеразы 20 ед./мкл и каждого рибонук-леозидтрифосфата 4 мМ.
Расщепление РНК-продукта. Растворы двойного рибозима (100 нМ) и РНК-продукта длиной 34 н. (2 мкМ), содержащего на 5'-конце остаток флу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.