»
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 8, с. 596 - 603
УДК 547.466.22
СИНТЕЗ СТЕАРОИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ПРОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ГИДРОФОБНЫХ ПЕПТИДОВ
© 1995 г. Ф. X. Исхакова*, О. В. Есипова, Е. Н. Звонкова
Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова,
117571, Москва, просп. Вернадского, 86 Поступила в редакцию 12,09,94 г.
Синтезированы стеароильные производные гидрофобных пролинсодержащих ди- и трипептидов и их дейтериймеченые аналоги. На основании данных ЯМР показано, что происходит сдвиг цис-/дранс-равновесия по связи Х-Рго (Х - ацильный или аминоацильный остаток.) в пользу транс-кон-формеров для соединений, содержащих в структуре фрагмент 81е-Рго, в отличие от соединений, где X - Вос-группа или остаток глицина.
Ключевые слова: пролин, пролинсодержащие пептиды, цис-транс-изомерия Х-Рго-связи, 'Н-, ,3С-ЯМР.
Продолжая наши исследования по изучению поведения коротких гидрофобных пептидов, содержащих аминокислотные остатки Gly, Leu, Ala, Phe, Туг, в фосфолипидных модельных мембранах методами ЯМР широких линий [1 - 3], мы также обратили внимание на пептиды, содержащие остаток ¿-пролина. Короткие пролинсодержащие пептиды постоянно привлекают внимание исследователей в качестве инструментов для изучения взаимосвязи "структура-функция". Две особенности пролина определяют его функциональную роль в пептидах и белках: пирролидиновое кольцо и способность имидной связи Х-Рго существовать как в транс-, так и в цис-конфигурации [4]. Скорость цис-трянс-изомеризации вокруг про-линовой имидной связи Х-Рго зависит от полярности окружения, влияет на кинетику сворачивания глобулярных белков и формирования третичной структуры, лежит в основе биологического действия ряда пептидов и белков [4-8].
Ранее мы уже писали о синтезе октадециловых эфиров пролинсодержащих пептидов H-Phe-Pro-Gly-OOde и H-Phe-Gly-Pro-OOde и их дейтерийме-ченых аналогов [9]. Аминокислотная последовательность первого из них соответствует фрагменту ß-казоморфина. Пептидная часть другого - ретро-последовательность фрагмента брадикинина (Рго-Gly-Phe). Данная работа посвящена синтезу стеа-роильных производных трипептидов Pro-Gly-Phe и Gly-Pro-Phe, являющихся полными ретропосле-
Принятые сокращения: Ste - стеароил, Gly* - [Са-2Н2]гли-цин, IBC - изобутилхлоркарбонат, THF - тетрагидрофуран, TFA - трифторуксусная кислота, (М) и (ш) - мажорные и минорные сигналы в спектрах 1Н-ЯМР, Ode - октадецил.
* Автор для переписки.
довательностями вышеназванных октадециловых эфиров, а также их дейтериймеченых аналогов.
Синтез осуществлялся по приведенным ниже схемам. Полностью защищенные дипептиды были синтезированы DCC/HOBT-методом (схемы 1 и 2). Метод смешанных ангидридов оказался неприемлемым, так как Sle-Gly-OH и особенно Ste-Pro-OH образуют нереакционноспособные смешанные ангидриды с изобутилугольной кислотой. Ste-Gly-Pro и его 2Н-меченый аналог Ste-Gly*-Pro были синтезированы в виде метиловых эфиров с выходом до 46%. Ранее [10] было установлено, что при омылении метилового эфира Z-Pro-Gly-OCH3 связь Pro-Gly почти полностью гидролизуется, а в случае Z-Gly-Pro-OCH3 потери, вызванные гидролизом этой связи, достигают 30%. В нашем случае при замене Z-защитной группы на стеароильную омыление метилового эфира также сопровождалось гидролизом связи Gly-Pro и выход составил 69%. В связи с этим Ste-Pro-Gly был синтезирован в виде трет-бутилового эфира (IV). Даже в этом случае при увеличении времени реакции мы наблюдали частичный гидролиз связи Pro-Gly, несмотря на то что реакция проводилась в значительно более мягких условиях отщепления трет-бутилового эфира в присутствии трифтор-уксусной кислоты по сравнению с условиями отщепления метилового эфира.
Для синтеза Ste-Pro-Gly*-OH (VII*) и Ste-Pro-Gly-OH (VII) мы воспользовались альтернативным путем, который заключался в присоединении стеароильного остатка с помощью N-гидрокси-сукцинимидного эфира стеариновой кислоты к дипептидам (VI *) и (VI) (схема 3). Незащищенные дипептиды (VI, VI*) получали путем удаления
Pro
G1 у
ОСН Ste-
ОСН, Ste-
(d), (Н*)
ОН
Ste-
(III) —он н-- DCC/HOBT
(IV)
TFA
OBu'
0Bu<
-ОН
Схема 1. Синтез стеароильных производных дипепти-дов Gly-Pro.
(VII)
Схема 2. Синтез стеароильных производных дипепти-дов Pro-Gly.
Pro
Вос-Вос-
Н-
Ste-Ste-
-он
н-
Gly
Phe
IBC
(V), (V*) TFA
(VI), (VI*) SteüNSü
(VJ[), (Vil*)
-OH -OH
-OH
-OH
H-
DCC/HOBT
-OBu'
-OBli'
(VIH), (VIII*)
Схема 3. Синтез стеароильных производных трнпептидов, содержащих фрагмент Pro-Gly.
(XI), (XI*)
Схема Синтез стеароильных производных трипептидов, содержащих фрагмент Gly-Pro.
Приминание. Звездочкой отмечены соединения, содержащие [Са~2Н2]глиции.
Вос-защитной группы с пептидов (V) и (V*), синтезированных методом смешанных ангидридов. При очистке Ste-Pro-Gly-OH (VII) и Ste-Pro-Gly*-OH (VII*) на перекристаллизация, ни адсорбционная колоночная хроматография на силикагеле не позволили добиться высокой степени чистоты пептидов при удовлетворительном выходе. Проблем}' удалось решить, используя ВЭЖХ на обращенной фазе с элюированием метанолом и рефрактометрическим детектированием, так как соединения (VII) и (VII*) не поглощают в УФ-области.
При синтезе трипептидов мы вновь обратились к DCC/HOBT-методу (схемы 3 и 4). Ste-Pro-Gly-Phe-OBu' (VIII) и Ste-Pro-Gly*-Phe-OBu' (VIII*) были синтезированы по схеме 2 + 1 с выходами 73 и 75% соответственно. При синтезе Síe-Gly-Pro-Phe-ОСНз (XI) и Ste-Gly*-ProPhe-ОСН-, (XI*) мы воспользовались схемой I + 2. В отличие от достаточно высоких выходов при создании связи Gly-Phe в синтезе трипептидов (VIII) и (VIII*) выход при создании связи Gly-Pro при синтезе (XI) и (XI*) достигал лишь 24%.
Таким образом, при синтезе стеароильных производных связь О1у-Рго образуется труднее и с меньшими выходами, чем пептидная связь Рго-С1у, которая синтезируется легче, но настолько лабильна, что гидролизуется даже в процессе перекристаллизации или проведения адсорбционной колоночной хроматографии.
Метод 'Н-ЯМР-спектроскопии в применении к стеароильным производным пептидов пролина позволил наблюдать существование в неполярном растворителе СПС13 двух конформеров по Х-Рго-связи. Если в растворе присутствуют оба конформера, то сигнал а-СН-протона пролина в 'Н-ЯМР-спектре всегда представляет собой совокупность мажорного и минорного мультиплетов [11]. Иногда интенсивность минорного сигнала ос-СН-протона пролина бывает достаточно велика, например в 'Н-ЯМР-спектрах Вос-Рго-ОН, Вос-Рго-ОШе [9], 81е-С1у-Рго-ОН (И). Интенсивности
мажорного и минорного сигналов а-СН-протонов пролина для этих соединений соотносятся как 3 : 2. Но, когда равновесие значительно сдвинуто в сторону одного из конформеров, интенсивность минорного сигнала а-СН-протона пролина бывает незначительна, и утверждать с уверенностью, что имеется второй конформер, можно, только если еще какой-либо сигнал 'Н-ЯМР-спектра представляет собой совокупность мажорного и минорного [11]. Соотношение этих сигналов может изменяться, вплоть до исчезновения одного из них, при изменении концентрации, смене растворителя, добавлении солеобразующих или ком-плексообразующих соединений [11 - 13].
При анализе 'Н- и 13С-ЯМР-спектров синтезированных соединений (I, I*, II, II*, III, ÍV, VII, VII*, VIII, VIII*, XI, XI*) нами были отмечены следующие особенности (см. таблицы):
Таблица 1. Химические сдвиги (5, м. д.) и константы спин-спинового взаимодействия (Л Гц) характеристических мажорных (М) и минорных (т) сигналов в 'Н-ЯМР-спектрах цис-транс-конформеров пептидов, содержащих связь Х-Рго
№ Соединение a CH Pro a СН2 Gly NH Gly и/или NHPhe ОСН3 или OBu' Соотношение интенсивностей сигналов (М): (ш)
5, m. д. Лх. ГЦ 5, м. д. Sab'> Ах Ubx) 8, м. д. Ах. Гц
- Вос-Рго-ОН 4.23 дд(ш) 4.0; 8.0 3 : 2
4.34 дд(М) 3.0; 8.0
(III) Ste-Pro-OH 4.20 дд(т) >10 : 1
* 4.57 дд(М) 2.0; 8.0
(VII) Ste-Pro-Gly-OH 4.40 дд(гп) 4.0; 7.0 3.88 дд 17.0; 4.0 7.1 т(т) ** - 4 : 1
4.57 дд(М) 2.0; 8.0 4.09 дд 17.0; 5.0 7.37 т(М) **
(И) Ste-Gly-Pro-OH 4.37 дд(ш) 4.0; 7.0 3.99 дд 17.0; 4.0 6.57 т(М) - 3 : 2
4.55 дд(М) 4.0; 7.0 4.16 дд 17.0; 5.0 6.90 т(ш) **
(IV) Ste-Pro-Gly-OBu' 4.33 дд(ш) 5.8; 5.4 3.85 дд(т) ^.в; 5.9 6.40 т(т) 5.9 1.44 с 6 : 1
3.97 дд(т) 18.8; 5.9
4.62 дд(М) 2.0; 8.0 3.86 д(М) 5.4 7.36 т(М) 5.4
(I) Ste-Gly-Pro-ОСНз 4.40 м(т) 4.5; 6.0 3.99 дд 17.0; 4.0 6.42 т ** 3.73 с(М) 4 : 1
4.55 м(М) , 4.0; 8.0 4.11 дд 17.0; 5.0 3.76 с(т)
(VIII) Ste-Pro-Gly-Phe-OBu' 4.30 дд(т) * 3.69 дд 17.0; 5.0 6.30 д(ш) * 1.35 с(М) >10 : 1
4.45 дд(М) 4.0; 7.0 4.13 дд 17.0; 7.0 6.97 д(М) 7.5 1.39 с(т)
6.75 дд(т) *
7.43 дд(М) 7.0; 5.0
(XI) Ste-Gly-Pro-Phe-OCH3 4.30 дд(т) * 3.82 дд 17.8; 3.7 6.40 т ** 3.73 с 10 : 1
4.03 дд 17.8; 4.2 6.80 д(ш) 8.6
4.54 дд(М) 1.9; 7.8 -7.1 (М) ***
* Константа ССВ не указана вследствие низкой интенсивности минорных сигналов. ** Сигналы имеют характер уширенных триплетов. *** Сигнал перекрывается сигналом ароматического кольца РЬе.
Таблица 2. Характеристические сигналы в 13С-ЯМР-спектрах стеароильных производных гидрофобных пролинсодержащих пептидов*
•ч
№ по Соединение Pro Gly Phe -Ste OR
схеме CP cY c5 Г с Мх cp C2 C3 C4 - C15 C16 C17 C18
(III) Ste-Pro-OH 60.56 27.56 24.99 22.60 48.40 34.92 25.23 29.77 29.88 30.10 32.36 23.11 14.48
(VII) Ste-Pro-Gly-OH 60.18 28.27 25.11 48.12 42.0 - - 35.11 25.36 29.90 30.11 32.35 23.09 14.48 -
(И) Ste-Gly-Pro-OH 59.64 29.28 31.71 25.02 22.72 46.71 47.19 42.29 - - 36.79 26.05 29.75 29.91 30.10 32.34 23.07 14.48 -
(IV) Ste-Pro-Gly-OBu' 60.03 27.78 25.23 47.94 42.65 - - 35.14 25.42 29.90 30.11 32.37 23.10 14.47 28.53 82.25
(I) Ste-Gly-Pro-OMe 60.22 29.18 25.04 46.69 42.40 - - 36.90 26.03 29.86 30.10 32.37 23.09 14.47 53.70
(VIII) Ste-Pro-Gly-Phe-OBu' 60.42 28.02 25.02 47.89 43.67 54.22 38.45 35.05 25.47 30.08 32.33 23.08 14.44 28.37 82.50
(XI) Ste-Gly-Pro-Phe-OMe 60.40 27.42 25.08 46.66 42.49 52.68 38.38 36.96 26.12 29.80 30.10 32.36 23.09 14.44 53.52
О S ЕЕ Н
И со
W >
чз О S
ы tr Е
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.