БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып.. 6, с. 857 - 867
УДК 577.114:547.458.88
СИНТЕЗ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ПЕКТИНОВ И ИХ АНТИКОАГУЛЯНТНАЯ АКТИВНОСТЬ
© 2010 г. Ф.В. Витязев1*, В.В. Головченко1, О.А. Патова1, Н.Н. Дрозд2, В.А. Макаров2, А.С. Шашков3, Ю.С. Оводов1
1 Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, 167982 Сыктывкар, Первомайская, 50; факс: (821)224-1001, электронная почта: ovoys@physiol.komisc.ru
2 Гематологический научный центр РАМН, 125167 Москва,
Новый Зыковский пр., 4а; факс: (495)614-7611, электронная почта: nndrozd@mail.ru
3 Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, 119991 Москва, Ленинский пр., 47; факс: (495)135-5328,
электронная почта: shash@ioc.ac.ru
Поступила в редакцию 22.07.09 После доработки 13.10.09
Проведено сульфатирование пектинов: бергенана BC, пектина бадана толстолистного, лемнана LM, пектина ряски малой, а также галактуронана — главной углеводной цепи пектинов. В качестве сульфатирующих реагентов использовали монометилсульфат пиридина, пиридинсульфотриоксид, хлорсульфоновая кислота. Показано, что оптимальным реагентом для сульфатирования галактуронана и пектинов является хлорсуль-фоновая кислота. Получены производные галактуронана и пектинов с различной степенью сульфатирова-ния, определена их антикоагулянтная активность и показано, что антикоагулянтная активность полученных сульфатированных производных зависит от количества сульфатных групп в их макромолекуле.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: лемнан, бергенан, пектинсульфаты, сульфатированный галактуронан, антикоагулянтная активность, Bergenia crassifolia L., Lemna minor L.
Проблема поиска препаратов, обладающих лекарственным эффектом и не оказывающих побочных действий на организм, всегда остается актуальной. Это относится и к антикоагулянтам — веществам, которые снижают свертываемость крови путем угнетения биосинтеза фибрина. Различают антикоагулянты прямого действия, понижающие активность тромбина и других сериновых протеаз в крови, и антикоагулянты непрямого действия, нарушающие образование протромбина, факторов X, XI и VII в печени, которые участвуют в свертывании крови [1].
Антикоагулянтами непрямого действия являются лекарственные препараты кумаринового и индандионового ряда, но они имеют много побочных эффектов, таких как токсичность, большой латентный период, склонность к кумуляции, наличие отдаленных последствий и т.д. Именно эти факторы и привели к ограничению применения подобных препаратов в антикоагу-лянтной терапии [2].
* Адресат для корреспонденции.
Меньшим спектром побочных действий обладают препараты гепарина: нефракциониро-ванный гепарин и низкомолекулярный гепарин (фраксипарин, эноксапарин, дельтапарин и др.), кислый сульфатированный линейный полисахарид, выделяемый из животной ткани, являющийся антикоагулянтом прямого действия, ингибирующий активированные 1Х—Х11 факторы свертывания крови, блокирующий биосинтез тромбина [3, 4].
Однако средне- и низкомолекулярные фракции гепаринов имеют ряд побочных эффектов, таких как геморрагии, аллергические реакции, тромбоцитопения. Кроме того, при использовании гепаринов, которые являются полисахаридами исключительно животного происхождения, существует вероятность передачи прионов от животных человеку и заражения бычьей энцефалопатией [5, 6].
Антикоагулянтная активность гепарина связана с особенностями строения его молекулы: с размером, наличием сульфатных групп в составе. Кроме того, важное значение имеет уникаль-
ная пентасахаридная последовательность, активирующая конформационные изменения в плазменном ингибиторе сериновых протеаз свертывающей системы крови — антитромбине. Было показано, что активность гепариновых фракций, в которых на дисахаридную структурную единицу приходится четыре сульфатные группы, в 1,5 раза превышает активность фракции гепарина с тремя сульфатными группами, также [7].
Показано, что сульфатирование таких полисахаридов, как целлюлоза, галактоманнаны хи-тозана, декстрана приводит к появлению у них антикоагулянтных свойств [8—11].
Большой класс растительных полисахаридов составляют пектины, присутствующие практически во всех высших растениях, не имеющие, как правило, в своем составе сульфатных групп и проявляющие разностороннюю физиологическую активность: иммуномодулирующую, ан-тидотную, антиоксидантную, гастропротектив-ную [12—16]. До настоящего времени не изучено влияние введения сульфатных групп в макромолекулу пектинов на их физиологическую активность и антикоагулянтные свойства.
В данной работе изучены условия сульфати-рования физиологически активных пектинов: лемнана, пектина ряски малой Lemna minor L., бергенана, пектина бадана толстолистного Bergenia crassifolia L., а также галактуронана, главной углеводной цепи; определена зависимость степени сульфатирования от условий проведения реакции и сульфатирующего реагента; выявлена корреляция антикоагулянтных свойств сульфатированных пектинов со степенью их сульфатирования.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Общие аналитические методы. Содержание гликуроновых кислот определяли по реакции с 3,5-диметилфенолом в присутствии концентрированной серной кислоты и калибровочному графику, построенному для D-галактуроновой кислоты, фотоколориметрирование проводили при 400 и 450 нм [17].
Содержание сульфатных групп определяли по методу Доджсона и калибровочному графику, построенному для сульфата калия, фотоколори-метрирование проводили при 360 нм [18]. Спектрофотометрические измерения проводили на приборе Ultrospec 3000 (Англия).
Качественное и количественное определение нейтральных моносахаридов в виде соответствующих ацетатов полиолов проводили с помощью ГЖХ на хроматографе Hewlett-Packard 4890A (США) с пламенно-ионизационным детекто-
ром и интегратором HP 3395А на капиллярной колонке RTX-1 (0,25 мм 0х 30 м, Restek), газ-носитель — гелий. ГЖХ ацетатов полиолов проводили в программе: от 175° (1 мин) до 250° (2 мин) со скоростью 3°/мин. Процентное содержание моносахаридов от суммарного препарата вычисляли из площадей пиков, используя коэффициенты отклика детектора [19]. В качестве внутреннего стандарта использовали мио-инозит.
Количество метоксильных групп определяли по ранее описанному методу [20] и калибровочному графику, построенному для метанола, фо-токолориметрирование проводили при 412 нм.
Молекулярную массу образцов определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Образец (2 мг) растворяли в 0,15 М NaCl (1 мл), раствор фильтровали. Для анализа использовали хроматографическую систему («Shimadzu», Япония): насос LC-20AD, дегазатор DGU-20A3, рефрактометр RID-10A, термостат CTO-10AS, колонку Shodex Asahipak GS-620HQ (7,5 мм х 30 см), предколонку Shodex GS-26 7В (7,6 мм х 5 см). Элюирование проводили 0,15 М NaCl при 40° со скоростью потока 0,3 мл/мин. Для калибровки колонки использовали образцы сульфатированных декстранов с молекулярной массой в диапазоне 36—50, 100, 400-600 и 1400 кДа («Sigma», USA). Процентное содержание определяли от общей площади пиков.
Удельное вращение галактуронана определяли на приборе Polartronic MHZ (Германия) при 20°.
ИК-спектры образцов, обезвоженных в пистолете Фишера в вакууме над P2O5 при температуре 60°, регистрировали на спектрофотометре Specord M80 (v0 = 4000 см-1, vs = 400 см-1, IT = 1). Образцы по 2 мг анализировали в виде таблеток, полученных прессованием с KBr [21].
Спектры ЯМР снимали на приборе DRX-500 фирмы «Bruker» (Германия) для 3-5%-ных растворов образцов в D2O при 303° К (внутренний стандарт — ацетон, §н 2,225 м.д., §с 31,45 м.д.).
Полный кислотный гидролиз. К навеске (4-6 мг) исследуемого образца добавляли 1 мл 2 М трифторуксусной кислоты (TFA), содержащей мио-инозит (1 мг/мл). Смесь термостатиро-вали 5 ч при 100°. Избыток кислоты удаляли многократным упариванием гидролизата с метанолом. Полученные моносахариды идентифицировали с помощью ГЖХ в виде соответствующих ацетатов полиолов [19].
Получение галактуронана. К навеске 250 мг бергенана BC добавляли 50 мл 2 М TFA, смесь термостатировали 2 ч при 100° и центрифугировали в течение 20 мин при 4° и 7943g (гср 9,2 см). Полученный осадок растворяли в воде, добавляя 2 М раствор аммиака до рН ~5, раствор диа-
лизовали и лиофилизовали. Получили галакту-ронан ВСН с выходом 100 мг, [а]20589 44 2 46° (0,1 г на 100 мл водн. аммиака), содержание остатков Б^а1А составляет 98,6%.
Получение триэтиламмониевой соли галакту-ронана проводили как описано ранее [19]. Галак-туронан растворяли в дистиллированной воде, диализовали против 1%-ного водного раствора гидрохлорида триэтиламина 24 ч и затем против дистиллированной воды еще 24 ч. Раствор триэ-тиламмониевой соли галактуронана лиофили-зовали и обезвоживали в пистолете Фишера над Р205 при температуре 60°.
Получение монометилсульфата пиридина. Для получения монометилсульфата пиридина использовали ранее описанный метод [22]. К охлажденному абсолютному метанолу (88 мл) при непрерывном перемешивании медленно приливали конц. серную кислоту (48 мл), полученную смесь оставляли при 4° на 24 ч. Затем к реакционной смеси при температуре 10—15° добавляли пиридин до рН ~7 и оставляли при 4° на 12 ч. Выпавший осадок отделили фильтрованием и промывали пиридином (5 х 20 мл). Полученные белые кристаллы монометилсульфата пиридина сушили в пистолете Фишера над Р205 при температуре 60°. Получили монометилсульфат пиридина с выходом 46,6 г.
Сульфатирование галактуронана монометил-сульфатом пиридина. Сульфатирование мономе-тилсульфатом пиридина проводили по ранее описанному методу [22]. К триэтиламмониевой
соли галактуронана (66,0 мг) добавляли диме-тилфорамид (ДМФА) (15 мл), смесь перемешивали при 60° 0,5 ч, затем добавляли разное количество монометилсульфата пиридина (458,0 или 733,0 мг). Далее реакцию проводили при температуре 80° в течение определенного времени: 0,5, 1,5 и 3 ч. Реакционную смесь охлаждали, добавляли 0,5 М №0Н до рН ~6—7, диализовали против дистиллированной воды и лиофилизова-ли. В результате получили шесть образцов суль-фатированного галактуронана с различной степенью сульфатирования (выходы представлены в табл. 1).
Сульфатирование галактуронана пиридинсуль-фот
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.