научная статья по теме СИНТЕЗ ЦИКЛИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ 4-Й ПЕТЛИ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ Химия

Текст научной статьи на тему «СИНТЕЗ ЦИКЛИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ 4-Й ПЕТЛИ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2008, том 34, № 5, с. 617-629

УДК 577.112:577.175.82

СИНТЕЗ ЦИКЛИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ 4-Й ПЕТЛИ ФАКТОРА

РОСТА НЕРВОВ

© 2008 г. А. А. Морозова*, Н. В. Сумбатян2*, В. П. Лезина*, В. X. Акпаров3*,

Г. А. Коршунова4*, Т. А. Гудашева*#

*ГУ НИИ фармакологии им. ВВ. Закусова РАМН, 125315, Москва, ул. Балтийская, 8;

2*Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова;

3*ФГУП Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва;

4*НИИ физико-химической биологии им. А Н. Белозерского, Москва Поступила в редакцию 29.08.2007 г. Принята к печати 16.01.2008 г.

Синтезированы циклические пептиды cyclo(-Gly-Asp-Glu-Lys-), cyclo(-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-) и cyc-lo(-Gly-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-), моделирующие Р-изгиб 4-й петли фактора роста нервов. Соответствующие защищенные линейные предшественники были получены твердофазным методом с применением Fmoc/Bu'-стратегии и хлортритильной якорной группы с выходами 52-83%. Циклизация проводилась под действием гексафторфосфата бензотриазолилокси-трис(диметиламино)фосфония (BOP), гек-сафторфосфата ^-[(Ш-бензотриазол-1-ил)-(диметиламино)метилен]-^-метилметанаминий-^-оксида (HBTU) и дифенилфосфорилазида (DPPA) и разбавлении 10-3 М, причем для каждого циклопептида было изучено распределение продуктов реакции в зависимости от типа конденсирующего агента. Показано, что использование DPPA позволяет полностью подавить образование циклодимеров в синтезе пяти и шестичленного циклопептида, однако для достижения такого эффекта в случае четырехчленного пептида потребовалось дополнительное десятикратное разбавление реакционной смеси. Идентификация в ходе синтеза нескольких побочных продуктов позволяет констатировать, что наращивание полипептидной цепи при использовании BOP-реагента может осложняться значительной рацемизацией, а расщепление хлортритильной якорной группы 0.5% TFA в дихлорметане протекает недостаточно селективно и сопровождается преждевременным Boc-деблокированием боковой функции лизина.

Ключевые слова: фактор роста нервов (NGF); аналоги; синтез; твердофазный пептидный синтез; циклические пептиды.

ВВЕДЕНИЕ

Фактор роста нервов (NGF) относится к семейству нейротрофинов, взаимодействует с рецепторами TrkA и р75, участвует в дифференцировке нейронов, усиливает рост дендритов и увеличивает выживаемость определенных видов нейронов в центральной и в периферической нервных системах [1]. Многочисленные данные указывают на то, что вещества с активностью NGF могут быть полезны в лечении ряда нейродегенеративных заболеваний, таких, как болезни Альцгеймера, Паркинсона, хорея Хантингтона, амиотрофический латеральный склероз, периферическая диабетическая нейропа-

Сокращения: BOP - бензотриазолилокси-трис(диметилами-но)фосфоний, гексафторфосфат; Clt - 2-хлортритильная группа; DIEA - диизопропилэтиламин; DPPA - дифенилфос-форилазид; ESI-MS - масс-спектрометрия с электроспрейной ионизацией; Fmoc - 9-флуоренилметилоксикарбонил; HBTU -гексафторфосфат ^[(1Я-бензотриазол-1-ил)-(диметилами-но)метилен]-^метилметанаминий-^оксида; NGF - фактор роста нервов; PyBOP - бензотриазолилокси-трис(пирролиди-но)фосфоний, гексафторфосфат.

# Автор для связи (тел.: (495) 601-23-73; факс: (495) 151-12-61; эл. почта: sosnovka@mtu-net.ru).

тия, инсульты, опухоль нейроэктодермы и др. [2, 3]. Терапевтическое использование NGF ограничивается его нестабильностью в биологических жидкостях, плохой способностью к проникновению через гематоэнцефалический барьер, возможностью иммунной реакции. Кроме того, такие соединения являются экономически невыгодными для медицинского применения вследствие высоких затрат на их производство. Несмотря на это, NGF продвигался в качестве лекарственного препарата для лечения болезни Альцгеймера и нейропатий, вызванных диабетом и СПИДом, но был снят c клинических исследований из-за тяжелых побочных эффектов [4].

NGF представляет собой белок, состоящий из двух идентичных полипептидных цепей, по 118 а. о. каждая (рис. 1). Кристаллографические исследования [5, 6] показывают, что каждый протомер NGF имеет семь Р-тяжей, образующих три антипараллельные пары. При этом Р-тяжи связаны четырьмя экспонированными наружу нерегулярными участками, называемыми петлями 1 (остатки 28-36), 2 (43-49) и 4 (91-98), а также серией из трех последовательных изгибов, или 3-й петлей (остатки 59-

2-я петля 43-49

4-я петля 91-98

1-я петля 28-36

Рис. 1. Структура NGF по данным РСА [6].

66). Исследования по мутагенезу NGF показали, что остатки Val48, Pro49, входящие в состав 2-й петли, и остаток Gln96, входящий в петлю 4, важны для связывания с рецептором TrkA [7]. В работе Ф.М. Лон-го и M. Манторпа [8] показано, что циклические гепта- и октапептиды, включающие 5-6 а. о. из последовательностей 1-й, 2-й или 4-й петель, ведут себя как агонисты NGF, увеличивая выживаемость нейронов. Нашей задачей являлось синтезировать циклопептидные аналоги NGF, содержащие только 3 а. о. из последовательности 4-й петли, для выяснения наиболее короткого активного фрагмента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве объекта моделирования нами была выбрана наиболее экспонированная наружу 4-я петля КОБ, образованная остатками 93-96: -А8р-О1и-Бу8-О1п-. Пептидные аналоги этой петли обладают большим сродством к ТгкА-рецептору по сравнению с аналогами других петель [9]. Молекулярное моделирование с использованием программы ЫурегСИеш показало, что конформация Р-пово-ротного участка 4-й петли подобна конформации 4-членного модельного циклопептида еуе1о(-А8р-О1и-Бу8-О1у-) (рис. 2). В его состав мы включили

Asp 93

Рис. 2. Совмещение тетрапептидного участка 93-95 4-й петли КОБ (из РСА-данных) и теоретической модели сус1о(А$р-01и-Ьу$-01у) (темный цвет).

аминокислотные остатки, относящиеся к центральному дипептидному фрагменту Р-изгиба, и предшествующий ему остаток аспарагиновой кислоты -для того, чтобы выяснить его роль в активности КОБ. В качестве четвертого остатка вместо О1п96 (для исключения влияния его бокового радикала) мы взяли глицин. Циклопептиды более устойчивы к протеолизу, чем линейные пептиды, так как не распознаются экзопротеиназами. Отсутствие заряженных концевых групп облегчает их транспорт через клеточные мембраны и приводит к лучшему биоаккумулированию. Эти свойства дают значительные преимущества циклопептидам с точки зрения терапевтического применения, по сравнению с соответствующими линейными аналогами.

Для более детального изучения влияния конформации пептида на активность мы синтезировали еще два циклопептида-гомолога, содержащие ту же самую последовательность А8р-О1и-Бу8 и, соответственно, два и три остатка О1у. Таким образом, нами были синтезированы следующие циклические пептиды - аналоги 4-й петли КОБ: еуе1о(-О1у-А8р-О1и-Бу8-) (VIII), еуе1о(-О1у-О1у-А8р-О1и-Бу8-) (IX) и еуе1о(-О1у-О1у-О1у-А8р-О1и-Бу8-) (X).

Защищенные по боковым группам линейные предшественники Ы-О1у-А8р(ОБиг)-О1и(ОБиг)-Бу8(Бое)-ОЫ (I), Ы-О1у-О1у-А8р(ОВиг)-О1и(ОВиг)-Бу8(Вое)-ОЫ (II), Ы-О1у-О1у-О1у-А8р(ОВиг)-О1и(ОВиг)-Бу8(Вое)-ОЫ (III) были получены твердофазным методом с использованием стандартной Бшое/Биг-стратегии для ступенчатого наращивания цепи с С-концевого остатка Ы-Бу8(Бое)- на полимерной подложке с 2-хлортритильной якорной группой [10] (схема 1). Высококислотолабильные трити-ловые эфиры могут быть селективно расщепле-

Gly

Gly

Gly

Asp

Glu

Lys

Fmoc—OH

Fmoc-

H-

Fmoc-

Fmoc-

H

H

Fmoc Fmoc OH H H

Fmoc Fmoc HH

OBu' OH

OBu'

I/_

Fmoc H

OBu'

OBu'

OBu'

OBu'

OBu'

OBu' Boc

OH H

OBu' Boc \

OBu' Boc \

OBu' / Boc \

OBu' Boc \

OBu' У Boc \

OBu' Boc

OBu' / Boc

OBu' Boc

OBu' / OBu' Boc

OBu' У OBu' Boc / \

OBu' OBu' Boc \

OBu' OBu' Boc

-O-Clt-g) -O-Clt-g) -O-Clt-g)

- O-Clt-R

- O-Clt-g)

- O-Clt-g -

OH x TFA (I)

- O-Clt-g) —

-O-Clt-g — -OH x TFA (II)

-O-Clt-g) — OH x TFA (III)

Схема 1. Блок-схема твердофазного пептидного синтеза линейных пептидов (I)-(III).

ны 0.5% TFA/CH2Cl2 [11], что должно позволить нам получить защищенные по боковым цепям линейные пептиды, пригодные для последующей циклизации.

Действительно, в этих мягких условиях нами были получены трифторацетаты тетра-, пента- и гексапептидов (I)-(III) (схема 2), аминокислотный состав которых соответствовал ожидаемому. Однако ТСХ и аналитическая ВЭЖХ показали, что в каждом случае продукт синтеза содержал примеси, главные из которых были выделены (рис. 3) с применением препаративной ВЭЖХ. 1Н-ЯМР-анализ показал, что в спектрах этих соединений отсутствует характерный триплетный сигнал протона №Н-груп-пы остатка Lys, а интенсивность сигналов в области 1.37-1.38 м.д. соответствует только двум Би'-груп-пам. Это позволило сделать вывод, что побочные соединения (IIIb), (IIIc), (IIb), составляющие около 30% сырых продуктов синтеза 5- и 6-членных пептидов, образуются при отщеплении Вос-защитных групп от остатка Lys (табл. 1). Причиной этого, вероятно, явилась большая продолжительность обработки 0.5% TFA/CH2Cl2 для полного удаления целе-

вого пептида от смолы. В случае 4-членного пептида такой побочный продукт из-за малого содержания выделить не удалось. После очистки методом препаративной ВЭЖХ выход 6-, 5- и 4-членных линейных защищенных пептидов составлял 52, 56 и 87% соответственно.

Строение соединений (I)-(III), (IIIa)-(IIIc), (IIb) было подтверждено методом хН-ЯМР-спектроско-пии. В изученных соединениях протоны практически всех аминокислотных остатков дают индивидуальные сигналы (табл. 1). Отнесение сигналов в спектрах 1Н-ЯМР проводили на основании литературных данных по спектральным характеристикам аминокислотных остатков [12, 13].

В наших условиях гексапептид (III) получался в виде двух форм в соотношении 3 : 2. Эти вещества были идентифицированы как диастереомеры, так как имели близкие времена удерживания при ВЭЖХ (рис. 3) и одинаковые наборы сигналов в спектрах 1Н-ЯМР, соответствующие целевой структуре. Диастереомеры были легко различимы. Отличались не только хим. сдвиги почти всех протонов, но и константы спин-спинового взаимодействия.

ON

о

tri

S О О ч

ч >

д

Д л

м

о >

»

X Д

Д

Lys(Boc)-

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком