БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 20 * № 1 * 1994
УДК 547.963.32.057:542.95
© 1994 Т. С. Орецкая, Н. Г. Долинная, И. Н. Меренкова, Н. Ф. Крынецкая, Е. А. Романова, Е. М. Волков, М. Блюменфельд\ М. Вассер3. А. Шабарова
СИНТЕЗ ЦИКЛИЧЕСКИХ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ С НЕНУКЛЕОТИДНЫМИ ВСТАВКАМИ
Химический факультет Московского государственного университета
им. М. В. Ломоносова;
'Фирма «вепрей, Париж
Один из важных факторов, препятствующих широкому использованию синтетических олигонуклеотидов в качестве антисенсов, — их чувствительность к деградации под действием клеточных нуклеаз — может быть устранен, если вместо природных олигомеров применять их циклические аналоги [1, 2]. Описано несколько методов получения циклических олигонуклеотидов: лигирование в составе трехспирального комплекса [1] и прямой химический синтез [3, 4]. Первый способ не универсален из-за специфичности кода узнавания третьей цепью ДНК-мишени и, таким образом, не пригоден для циклизации олигомеров любой нуклеотидной последовательности. В то же время второй метод не является сиквенсзависимым и, следовательно, мог бы быть перспективным, однако описанные в литературе результаты [3, 4] и наш анализ возможностей этого подхода свидетельствуй ? том, что это сложная синтетическая задача.
Наилучшая стратегия получения циклических олигодезоксирибонуклеотидов, на наш взгляд, — циклизация синтетических линейных олигонуклеотидов на комплементарной матрице под действием бромистого циана (ВгСИ) (схема). Для повышения точности воздействия циклического зонда на НК-мишень, т. е. сведения к минимуму неспецифических контактов, а также для снижения вероятности образования шпилечных структур (при использовании 36—40-звенного олигонуклеотида избежать внутримолекулярного структурирования весьма сложно) .мы предлагаем заменить нуклеотидные остатки в незначащем участке антисенсового олигонуклеотида на остатки 1,2-дидезокси-£>-рибофуранозы (Я). Конформационная подвижность модифицированного участка в этом случае может облегчить образование цикла.
Опыт использования химического лигирования (ХЛ) [5] диктует ряд требований к дизайну линейных предшественников циклических олигонуклеотидов, которым мы следовали: а) длина олигонуклеотида была не меньше 32 звеньев, чтобы обеспечить образование стабильного дуплекса с матрицей (12—14 нукле-отидных пар) и достаточно длинный «огибающий» одноцепочечный участок, не препятствующий полноценному комплексообразованию; б) реагирующая фосфатная группа локализована на З'-конце линейного олигонуклеотида, что способствовало эффективному образованию фосфодиэфирной связи [6]; в) в участке лигирования контактировали нуклеотидные звенья, обеспечивающие наиболее эффективное ХЛ [7]. На схеме стрелкой указано положение новой межнукле-отидной связи, приводящей к образованию циклического продукта.
с
rRTRPtbbtb
С
-j-RRTRRTR
tRR (2) 3' T
Т Т
&&л-т 5
А' .ЧТССК „JC& . С G &Ä6& — ÄC&C С
f
& А г ° Г Т Т' .nTCp^X&AS- • 'А
& ÄÄ&-ftCTt А
X = Т (Tfl,2öj X = рТ(7гГ,25")
Модифицированные линейные предшественники циклических олигоме-ров (1а и 2а) содержали соответственно участки, комплементарные РНК вируса герпеса и 5S РНК Е. coli. Синтез олигонуклеотидов (1а и 2а), а также 14-звенных матриц (схема) был осуществлен стандартным амидофосфитным методом на автомате-синтезаторе «Applied Biosystems 380В» с увеличением времени конденсации на стадии присоединения модифицированного звена до 3 мин. З'-Амидофосфит 1,2-дидезокси-/)-рибофуранозы получали как описано нами ранее [8]. Эффективность присоединения модифицированного звена, как правило, не отличалась от таковой для немодифицированного. 5'-32Р-фосфорилированные олигонуклеотиды (16) и (26) получали из олиго-меров (1а) и (2а) соответственно с помощью 'Г4-полинуклеотидкиназы. BrCN-Индуцируемая реакция проводилась в условиях, оптимальных для химического лигирования линейных олигонуклеотидов [7]. Общая нукле-отидная концентрация не должна превышать Ю-4 М (на мономер), чтобы предотвратить конкурирующее образование димера исходного олигонукле-отида. Выход циклических олигомеров во всех четырех случаях (схема) составлял 90—95%. Циклизация нуклеотидного аналога соединения (1а) 5'-TGCGGGAACTGTTGGTAAAATGGAAGACGTTCCTCCp (3) протекает гораздо менее эффективно: выход циклического продукта не превышает (рис. 1).
Циклическая природа выделенного с помощью электрофореза в денатурирующем 20% ПААГ продукта лигирования была подтверждена несколькими методами. Полученное соединение устойчиво к действию смеси ферментов — фосфодиэстеразы змеиного яда и фосфомоноэстеразы, а также ExoVII. Кроме того, оно резистентно к введению 5'-32Р-метки под действием полинуклеотидкиназы и [у-32Р]АТР (данные не показаны). Убедительным подтверждением циклической структуры олигонуклеотида является характер расщепления по одному из оснований (анализ по Максаму — Гилберту) компонентов реакционной смеси, содержащих до проведения циклизации 5'-концевую 32Р-метку (рис. 2). Электрофоретическая подвижность циклического олигонуклеотида с пирофосфатной межнуклеотидной связью после первого же разрыва цепи скачкообразно меняется, совпадая с таковой для исходного олигомера (рис. 2), и олигонуклеотидную последовательность невозможно «прочитать» из-за того, что радиоактивная метка находится не на конце, а внутри анализируемой цепи.
Таким образом, разработан высокоэффективный и универсальный метод циклизации олигонуклеотидов — потенциальных антисенсов. Он предполагает включение в незначащую центральную часть олигомера ненуклеотидных вставок, сближение его концов на комплементарной матрице и ковалентное их соединение с помощью химического реагента.
1 GT AG 1 CT A С
Рис. 1 Рис. 2
Рис. 1. Электрофоретический анализ в 20% денатурирующем ПААГ продуктов ВгСИ-индуцируемой циклизации олигонуклеотида (1а) (дорожка 1) и его нуклеотидного аналога (3) (дорожка 2). Цифры сбоку указывают число нуклеотидных или 1,2-дидезокси-£>-рибофуранозных звеньев (например, 35Й); С и СБ обозначают циклический олигонуклеотид или цикл димерного продукта. Для визуализации соединений использовано прокрашивание бромистым этидием
Рис. 2. Авторадиограмма электрофореза в 20% ПААГ. Анализ нуклеотидной последовательности по Максаму — Гилберту олигонуклеотида (16) (А) и продукта его циклизации (Б). Дорожки 1 соответствуют линейному (А) или циклическому (Б) олигонуклеотидам, не подвергавшимся расщеплению
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Prakash G., Kool E. T.//J. Chem. Soc. Chem. Communs. 1991. P. 1161 — 1163.
2. Prakash G., Kool E. T.//J. Amer. Chem. Soc. 1992. V. 114. № 9. P. 3523—3527.
3. Vaman Rao M., Reese С. B.//Nucl. Acids Res. 1989. V. 17. № 20. P. 8221—8239.
4. De Vroom E., Broxterman H. J. G., Sliedregt L. J. M., van der Marel G. A., van Boom
J. H.//Nucl. Acids Res. 1988. V. 16. № 10. P. 4607—4618.
5. Shabarova Z. Л.//Biochimie. 1988. V. 70. P. 1323—1334.
6. Аширбекова Д. T., Соколова H. И., Долинная H. Г., Шабарова 3. А.//Биоорган, химия.
1989. Т. 15. № 12. С. 166—174.
7. Мерецкова И. #., Долинная Н. Г., Орецкая Т. С., Соколова Н. И., Шабарова 3. А.//Биоорган.
химия, 1992. Т. 18. № 1. С. 85—91.
8. Волков Е. М., Кубарева Е. А,, Сергеев В. Н,, Орецкая Т. С.//Химия природ, соединений.
1990. № 3. С. 417—419.
Поступило в редакцию 13.VII.1993
Т. S. Oretskaya, N. G. Dolinnaya, I. N. Merenkova, N. F. Krynetskaya, E. A. Romanova, E. M. Volkov, M. Blumenfeld % M. Vasseur *, Z. A. Shabarova
SYNTHESIS OF CYCLIC OLIGODEOXYRIBONUCLEOTIDES WITH NON-NUCLEOTIDE INSERTS
Department qf Chemistry, M. V. Lomonosov Moscow State University, Moscow;
* Genset Corporation, Paris
An effective method for the oligonucleotide cyclization using BrCN-induced chemical ligation was developed. The novel idea to incorporate non-nucleotide inserts makes the process of cyclizations independent of the inner secondary structure of the linear precursor. An set of assays were developed to confirm the cyclic structure of the compounds obtained.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.