т
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 4, с. 275 - 281
УДК 547:962,057:577.17J',5' 17
СИНТЕЗ ЦИКЛИЧЕСКОГО АНАЛОГА ЭНКЕФАЛИНА ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ
© 1995 г. И. В. Боброва*, Н. А. Мышлякова, О. С. Папсуевич, И. А. Восекална, Е. И. Мекшун
Латвийский институт органического синтеза, LV-1006, Рига, ул. Айзкрауклес, 21 Поступила в редакцию 22.12.93 г. После доработки 18.04.94 г.
Классическими и твердофазным методами иептидной химии синтезированы циклический аналог энке-фалина - cyclo(Lys-Tyr-DMet-Gly-Phe-Pro-) и два соответствующих линейных гексапептида, содержащих остаток лизина на N- и С-конце молекулы: Lys-Tyr-Z)Met-Gly-Phe-Pro и Tyr-DMet-Gly-Phe-Pro-T^s . Наблюдается значительная пролонгация анальгетического эффекта циклического аналога энке-фалина, исследованного методом "tail pinch" при интрацистернальном введении мышам. Циклоана-лог оказывает слабое влияние на периферические опиатные рецепторы изолированного сегмента подвздошной кишки морской свинки. Присоединение остатка лизина к N-концу молекулы пента-пептида энкефалина на порядок увеличивает селективность связывания с опиатным рецептором (1-типа.
Ключевые слова: энкефалин, аналоги; пептидный синтез.
В 1975 г. Хьюз и сотр. [1] выделили из мозга животных и химически охарактеризовали два пентапептида с опиоидным действием - [Met5]- и [Ьеи5]энкефалины. Было показано, что отсутствие анальгетической активности у энкефалинов при их внутривенном введении, а также кратковременность действия даже при введении в желудочки головного мозга объясняются их быстрым расщеплением под воздействием ферментов крови и спинномозговой жидкости. В последующие годы в целях поиска высокоактивных опиоидных пептидов были проведены многочисленные синтезы аналогов энкефалинов. Из огромного числа различных структурных изменений в молекуле энкефалинов, приводящих к повышению устойчивости соединений к действию ферментов и существенному усилению анальгетической активности с ее пролонгацией, можно выделить два основных типа; замещение глицина в положении 2 на D-аминокислоту и замещение или модификация (амидирование, этерификация и т.д.) С-кон-цевой аминокислоты пептида (см., например, работы [2, 3]). Удлинение пептидной цепи также может привести к усилению активности [4].
Особый интерес для дизайна [5] высокоактивных аналогов нейропептидов и гормонов представляет циклизация молекул линейных предшественников. Большая перспективность этого ме-
Принятые сокращения. вИ - подвздошная кишка морской свинки, \flVD - семявыносящий проток мыши, ОРГр - пен-тафторфенил.
* Автор для переписки.
тода впервые была продемонстрирована на примере синтеза циклобрадикинина, а позже и других многочисленных циклопептидов, в том числе циклоэнкефалинов [6 - 8]. ■
Надо полагать, что совмещение отмеченных выше наиболее существенных для биологической активности модификаций в одной молекуле может привести к более сильной пролонгации действия нового аналога по сравнению с аналогами с отдельными единичными модификациями.
В продолжение поиска высокоактивных аналогов энкефалинов пролонгированного действия в настоящей работе нами предпринят синтез нового
циклоаналога - cyclo(Lys -Tyr-Z)Met-Gly-Phe-Pro-) (I), модифицированного в положениях 2 и 5, с дополнительной вставкой остатка лизина. Циклическая структура соединения (1) сконструирована аналогично синтезированному нами ранее циклоаналогу
[Ьеи5]энкефалина - cyclo(Lys -Туг-Gly-Gly-Phe-Leu-), т.е. замыканием пептидной связи между е-амино-группой лизина и С-концевой карбоксильной группой пептида [8]. Для сравнения биологической активности получены также соответствующие линейные гексапептиды (II) и (III), содержащие остаток лизина в 6-м (остаток присоединен через е-аминогруппу) и нулевом положении соответственно, а также пентапептид (IV).
Tyr'-£>Met2-Gly3-Phe4-Pro5C}s6 (II) Lys°-Tyr1 -DMet2-Gly3-Phe4-Pro5 (III)
Туг1 -DMet2-Gly3 -Phe4-Pro5 (IV)
275
3*
Туг DMet GJy Н
Phe
Pro
Lys
Bzl Вое- ^ONp
H2/Pd; TFA
Boc Boc -Boc-Boc-Boc-TFA-
/
Boc -fOPfp Boc
Bzl
TFA
Bzl
Bzl
Bzl
Bzl
(V)
(Va)
(VI)
(Via)
Bzl
Bzl
OH OH
OH Boc+OPfp
OH Boc
OPfp
TFA
(VIII)
(Villa)
(IX)
(IXa)
(VII)
(Vila)
OH OH OH OH
H
OPfp \
z
OH
OH
Z^-OH-
z:
(X)
ly
H
(I)
(II)
H2/Pd
H^OlW
(IV)
OH
Схема синтеза лизиисодержащих аналогов [DMet2,
Рго5]энкефалина.
Синтез циклоаналога энкефалина (I), его линейного предшественника (П) и пентапептида (IV) проводили классическими методами пептидной химии в растворе (см. схему), аналога (III) - модифицированным твердофазным методом. Выбор защитных групп, условия циклизации не отличались от описанных ранее [8].
Дипептид (V) получали конденсацией пента-фторфенилового эфира Boc-DMet с натриевой солью глицина. Затем к деблокированному ди-пептиду (Va) присоединяли Boc-Tyr(Bzl)-ONp и получали защищенный трипептид (VI) с выходом 87%. Конденсацией соответствующих N- и С-кон-цевых фрагментов синтезировали защищенные пента- и гексапептиды (VIII, IX). Гексапептид (IX) деблокировали трифторуксусной кислотой и цик-лизовали дифенилфосфорилазидом [8]. Как видно из схемы, циклоаналог (X) получали, замыкая цепь между аминогруппой тирозина и карбоксильной группой лизина. Связь между е-амино-группой лизина и пролином была образована ранее. Выход циклического продукта реакции после хроматографического разделения образовавшейся при циклизации смеси веществ составил 40%. Синтез циклоаналога (I) был завершен гидрированием над палладиевой чернью в присутствии циклогексиламина. Использование метода
снятия защитных групп бензил ьного типа каталитическим гидрированием над палладиевой чернью ограничено для пептидов с серосодержащими аминокислотами. Чтобы не усложнять синтез другим, более трудоемким методом деблокирования, нами был успешно использован метод каталитического гидрирования серосодержащих пептидов в присутствии циклогексиламина, предложенный Медзиградским [9]. Циклическая структура синтезированного соединения (I) была подтверждена масс-спектроскопическим определением молекулярной массы вещества.
Деблокирование линейных пептидов (И, III, VI) проводили в аналогичных условиях.
Условия синтеза линейного гексапептида -[Lys0, DMet2, Рго5]энкефалина (III), проведенного твердофазным методом с использованием сефа-декса LH-20 в качестве носителя, показаны ранее в работе [10], за исключением способа присоединения первой аминокислоты к носителю. Пролин присоединяли к сефадексу LH-20 действием DCC в присутствии диметиламинопиридина.
Спектры КД (рисунок) [DMet2, Рго5]энкефали-
на (IV), cyclo(Lys°, DMet2, Рго5-]энкефалина (I) и его двух Lys-содержащих линейных аналогов (II) и (HI) в воде характеризуются группой максимумов
поглощения -ароматических переходов с малыми значениями эллиптичности: от 250 до 290 нм (Phe - 250 - 270 нм, Туг - 270 - 290 нм). Боковые цепи ароматических остатков Phe и Туг ориентированы одинаково. Положительная полоса дихро-ичного поглощения при 220 - 230 нм состоит из перекрывающихся полос амидного (п-к*) и ароматического !La-переходов (рисунок). Максимум
дихроичного поглощения при 190 - 200 нм относится к амидному 7t—«-^-переходу и свидетельствует о сходном пространственном строении пептидного остова у [DMet2, Рго5]энкефалина (IV), cyclo[Lys°, DMet2, Pro5-]энкефалина (I) и [Lys0, DMet2, Рго5]энкефалина (III), отличающегося от
строения [DMet2, Pro5, Lys6]энкeфaлинa (П). Введение Lys в С-концевую часть молекулы приводит к исчезновению положительного максимума дихроичного поглощения при 190 - 200 нм, что свидетельствует о конформационной перестройке основной пептидной цепи аналога (II).
Сходство спектров КД циклопептида (I), его линейного предшественника (III), содержащего лизин на N-конце молекулы, и [DMet2, Рго5]энке-фалина (IV) позволяет сделать вывод о близости их пространственной структуры.
Анальгетическая активность синтезированных аналогов энкефалина оценивалась по методу "tail-pinch" (прижатия хвоста) при интрацистер-нальном введении мышам [8, 11], влияние на периферические опиатные рецепторы - на препаратах
СИНТЕЗ ЦИКЛИЧЕСКОГО АНАЛОГА ЭНКЕФАЛИНА
277
подвздошной кишки морской свинки (GPT) и се-мявыносящем протоке мьшш (MVD) [8, 12]. Результаты исследования биологической активности приведены в табл. 1, 2.
Из табл. 1 видно, что новый циклический аналог (I) обладает высокой анальгетической активностью, превышающей активность природного энкефалина [13], хотя по сравнению с описанным в литературе пентапептидом (IV) [2] он несколько менее активен. Анальгетическая активность аналога с циклической структурой (I) практичес-.sj] ве отличается от активности линейного предшественника (III), однако аналог (I) имеет преимущество - он менее токсичен при исследовании на животных. В интервале изученных доз (0.1 -100 мкг/животное)_циклоаналог (I) не проявляет токсических эффектов в отличие от линейного аналога энкефалина (Ш), который в дозе 25 мкг/животное, хотя и вызывает устойчивый анальгетический эффект у 90% животных в течение 1.5 ч, приводит в iö-% случаев к летальному исходу.
Как и ожидалось, циклизация привела к существ-иной пролонгации анальгетического действия: продолжительность анальгезии при ЕЭ^.^ для циклоаналога (I) составляет 90 мин, для линейных предшественников (гексапептидов (П) и (ПТ)) - 60 мип (ср.: для энкефалина (XI) и линейного пентапептнда (IV) только 15 и 5 мин). Доза 100юг/животное вызывает анальгетический эффект циклоаналога (I) продолжительностью 2.5 ч.
Злаяние циклоаналога (I) на периферические опиатные рецепторы изолированного сегмента подвздошной кишки морской свинки (GPI) оказалось весьма низким: менее 1% активности [DMet2. Рго5]энкефалина (IV) (табл. 2).
Присоединение остатка лизина к N-концу [DMet2, Pro5] энкефалина увеличило р-активность (GPI) (160%) и уменьшило сродство к 5-типу рецептора (MVD) (3.7%), т.е. аналог (III) на порядок
[0] х 10"4, (град см2)/дмоль
Спектры кругового дихроизма аналогов (I) - (IV) энкефалина в дальней (а) и ближней (б) ультрафиолетовой области.
более селективен (индекс 43.2), чем ис-
ходный пентапептид (IV) (индекс 1). Та-
кой же вывод был сде
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.