ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 4, с. 486-489
УДК 631.466:582.1234:579222.3
СИНТЕЗ a-ЦИКЛОПИАЗОНОВОЙ КИСЛОТЫ ГРИБАМИ
РОДА Aspergillus
© 2007 г. Н. Г. Винокурова, Н. Е. Иванушкина, И. И. Хмельницкая, М. У. Аринбасаров
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Московская область, 142290; e-mail: arin@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 21.09.2005 г.
Изучали распространение а-циклопиазоновой кислоты (ЦПК) среди метаболитов грибов рода Aspergillus. Исследовано 138 культур из фонда ВКМ и собственной коллекции, относящихся к 13 видам. Показано, что ЦПК наиболее часто встречается среди метаболитов микромицетов секции Fla-vi (61% у A. flavus, 83% у A. oryzae, 100% у A. tamarii). Индекс креативности у A. versicolor составил менее 5%. Впервые показана продукция ЦПК у A. fumigatus и A. phoenicis (в 30% случаев для обоих видов).
а-Циклопиазоновая кислота (ЦПК) - мико-токсин, биогенетически образованный из молекулы триптофана, мевалоновой кислоты и двух молекул уксусной кислоты. Впервые описанная в 1968 году как токсический метаболит Penicillium cyclopium [1], ЦПК к настоящему времени хорошо изучена. Установлена ее структура, исследованы пути биосинтеза, выделены некоторые ферменты биосинтеза [2, 3].
Показано, что ЦПК обладает сильным нейро-токсическим свойством, вызывает мышечный тремор, судороги, заканчивающиеся гибелью, индуцирует злокачественные опухоли [4, 5]. Характер поражения печени ЦПК отличается от гепа-токанцерогеноза, вызванного афлатоксинами и стеригматоцистином [6].
ЦПК известна как природный загрязнитель продуктов питания и кормов, таких как сыры, кукуруза, орехи, зерновые, мясо и т.д. [5-7]. Проблема состоит также и в том, что этот микоток-син продуцируется грибами, используемыми в производстве ферментируемых продуктов и напитков [8].
ЦПК является общим вторичным метаболитом микроскопических грибов родов Penicillium и Aspergillus. Среди пенициллов ее продуцентами являются грибы видов P. aurantiogriseum (=P. cydopium, =P. puberulum), P. camemberti, P. solitum var. solitum (=P. patulum), P. solitum var. crustosum (=P. crustosum) и P. viridicatum [5-9]. К видам, обладающим наибольшей креативностью по отношению к ЦПК, относятся P. camemberti (ЦПК обнаружена у 68 штаммов из 69 изученных), P. commune (132 из 132), P. griseofulvum (40 из 40) и P. glandicola var. mononematosum (=P. mononemato-sum) (49 из 49) [10]. Среди продуцентов ЦПК описаны виды P. vulpinum (3 из 9) [11] и P. duclauxii (=P. clavigerum) (1 из 2) [12]. По данным Скотта [6] все выделенные из сыров изоляты P. camemberti
продуцировали ЦПК (63 из 63). К видам с высокой креативностью в отношение к синтезу ЦПК относится также P. aurantiogriseum (=P. cydopium (7 из 7), =P.puberulum (8 из 8)) [13].
Менее изучено распространение продуцентов ЦПК среди грибов рода Aspergillus. Лучше всех описан вид A. flavus, основной продуцент наиболее опасных микотоксинов - афлатоксинов. Так, исследовав более 1000 изолятов A. flavus из почв различных регионов США, Хорн и Дорнер обнаружили ЦПК у 83% штаммов [14]. Двадцать две из 23 изученных культур A. tamarii также являются продуцентами ЦПК [9]. Среди продуцентов ЦПК описаны единичные штаммы A. versicolor и A. oryzae [8, 15, 16]. Хермансен и др., изучив 3 штамма A. versicolor и 4 штамма A. oryzae, ЦПК обнаружили только у 2 штаммов A. oryzae [13].
Цель работы - изучить распространенность продуцентов ЦПК среди грибов рода Aspergillus.
МЕТОДИКА
Объект исследования. В работе использовали 138 культур 13 видов пяти секций грибов рода Aspergillus из фонда ВКМ и собственной коллекции, выделенные из разных местообитаний.
Секция Clavati: A. clavatus Desmazieres - BKM F-22, BKM F-738, BKM F-802, BKM F-1330, BKM F-1594, BKM F-2608; A.giganteus Wehmer - BKM F-29.
Секция Fumigati: A. fumigatus Fresenius - Ff-1, Ff-3, Ff-9, Ff-11, Ff-17, Ff-18, Ff-24, Ff-25, Ff-33, Ff-44, Ff-48, Ff-85, Ff-141.
Секция Flavi: A. flavus Link - BKM F-1024, Fl-1, Fl-2, Fl-3, Fl-6, Fl-11, Fl-12, Fl-13, Fl-14, Fl-20, Fl-23, Fl-24, Fl-31, Fl-44, Fl-57, Fl-58, Fl-63, Fl-132; A. oryzae (Ahlburg) Cohn - BKM F-45, BKM F-47, BKM F-49, BKM F-50, BKM F-51, BKM F-52, BKM F-53,
BKM F-55, BKM F-56, BKM F-71, BKM F-763, BKM F-2094, BKM F-2095, BKM F-2096, BKM F-2097, BKM FW-54, BKM FW-609, BKM FW-2419; A. tamarii Kita - BKM F-64, BKM FW-2704, BKM FW-2711.
Секция Nigri: A. aculeatus Iizuka - BKM FW-2415, BKM FW-2416, BKM FW-2417, BKM FW-2418; A. awamori Nakazawa - BKM F-746, BKM F-758, BKM F-808; A. carbonarius (Bainier) Thom -BKM F-21; A. japonicus Saito - BKM F-2145; A.niger van Tieghem - BKM FW-395, BKM FW-650, BKM FW-848, BKM FW-2532, BKM FW-2555, BKM FW-2556, BKM FW-2557, BKM FW-2558, BKM FW-2743, BKM FW-2744, BKM FW-2745, BKM FW-2746, BKM FW-2747, BKM FW-2748, BKM FW-2749, BKM FW-2750, BKM FW-2751, Fn-71, Fn-72; A.phoenicis (Corda) Thom et Currie - BKM F-2084, Fp-1, Fp-4, Fp-5, Fp-7, Fp-9, Fp-10, Fp-14, Fp-15, Fp-18, Fp-23, Fp-25, Fp-27, Fp-29, Fp-31, Fp-39, Fp-41, Fp-51, Fp-52, Fp-55, Fp-65, Fp-71, Fp-75, Fp-101, Fp-102, Fp-136, Fp-138, Fp-150, Fp-250, Fp-650.
Секция Versicolores: A. versicolor (Vuillemin) Ti-raboschi - BKM F-70, BKM F-804, BKM F-1114, BKM F-2546, BKM F-2993, BKM FW-438, BKM FW-447, BKM FW-681, BKM FW-722, BKM FW-916, BKM FW-2023, BKM FW-2752, Fv-1, Fv-2, Fv-3, Fv-4, Fv-5, Fv-20, Fv-40, Fv-50, Fv-80.
Культивирование. Для культивирования мик-ромицетов использовали среду следующего состава (г/л дистиллированной воды): маннит - 50.0, янтарная кислота - 5.4, MgSO4 ■ 7H2O - 0.3, KH2PO4 -1.0, pH доводили до 5.4 25%-ным раствором NH4OH. Микроэлементы добавляли перед засевом из расчета (мг/л): FeSO4 ■ 7H2O - 5.0, CuSO4 ■ ■ 5H2O - 3.3, ZnSO4 ■ 7H2O - 4.4, MnSO4 ■ 5H2O - 2.7, Na2MoO4 - 2.4. Засев проводили водной суспензией 7-суточных культур, выращенных в пробирках на мальт-агаре (3 % об./об.). Культивирование проводили в 150 мл среды в колбах Эрленмейера объемом 750 мл при 26°С на качалке (180-200 об/мин).
Выделение и анализ. Выделение ЦПК осуществляли на 6 и 12 сутки роста. Фильтрат куль-туральной жидкости (100 мл) подщелачивали 25%-ным раствором NH4OH до рН 8-9 и экстрагировали ЦПК хлороформом. Экстракт сушили над безводным Na2SO4, фильтровали и упаривали досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40°С.
Анализ экстракта осуществляли методом ТСХ на пластинах силуфола УФ-254 (Чехия) в системе этилацетат-метанол-25%-ный аммиак (85 : 15 : 10). Пробу растворяли в 100 мкл смеси хлороформ-метанол (1 : 1), аликвоту раствора (4-8 мкл) наносили на пластину силуфола параллельно со стандартом. В качестве стандартного образца использовали ЦПК, выделенную ранее из Penicillium pali-tans BKM F-3088 [17]. Метаболиты на пластинах обнаруживали по поглощению в УФ-свете и по-
Hi
11 i
12 3
Хроматограмма экстрактов культуральной жидкости Aspergillus oryzae BKM F-50, полученных при различных значениях рН; 1 - кислые (рН 2.0-3.0 ) 2 - стандарт ЦПК, 3 - щелочные (рН 8.0-9.0).
сле опрыскивания реактивом Эрлиха. Идентификацию ЦПК осуществляли по хроматографиче-ской подвижности, окраске с реактивом Эрлиха и по характерной форме пятна.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Современные методы анализа ЦПК включают ВЭЖХ, ТСХ, иммуно-ферментный анализ и спектрофотометрию [8]. Наилучшим признан метод ТСХ на силикагеле, обработанном щавелевой кислотой [8, 13]. Этот простой и доступный метод дополняется цветной реакцией с реактивом Эрлиха.
При использовании не обработанного щавелевой кислотой силикагеля, ЦПК в большинстве систем хроматографируется в виде длинного размытого пятна, что значительно снижает чувствительность метода. Однако, нами показано, что хорошие результаты при ТСХ можно получить, не импрегнируя пластины щавелевой кислотой, при использовании сильно полярной системы: этил-ацетат-метанол-25%-ный аммиак (85 : 15 : 10). В этом случае ЦПК образует достаточно компактное пятно со слегка заостренным верхом. Чувствительность определения составляет 0.5 мкг.
Поскольку ЦПК является амфотерным соединением, для выделения продукта можно применять экстракционные методы при различных значениях рН. Ввиду того, что в культуральной жидкости присутствуют значительные количества побочных продуктов кислого характера, нами предложено
488 ВИНОКУРОВА и др.
Распространенность продуцентов ЦПК среди изученных микромицетов рода Aspergillus
Вид
Число изученных штаммов
Число выявленных продуцентов ЦПК
Перечень продуцентов ЦПК
Индекс креативности
Секция Clavati
A. clavatus 6 0 0
A. giganteus 1 0 Секция Fumigati 0
A. fumigatus 13 4 Ff-9, Ff-11, Ff-33, Ff-141 Секция Flavi 31
A. flavus 18 11 Fl-1, Fl-2, Fl-6, Fl-11, Fl-12, Fl-13, Fl-23, Fl-24, Fl-58, Fl-63, Fl-132 61
A. oryzae 18 15 BKM F-45, BKM F-47, BKM F-49, BKM F-50, BKM F-51, BKM F-52, BKM F-55, BKM F-56, BKM F-71, BKM F-763, BKM F-2094, BKM F-2095, BKM F-2096, BKM FW-54, BKM FW-609 83
A. tamarii 3 3 BKM F-64, BKM FW-2704, BKM FW-2711 Секция Nigri 100
A. aculeatus 4 0 0
A. awamori 3 0 0
A. carbonarius 1 0 0
A. japonicus 1 0 0
A. niger 19 0 0
A. phoenicis 30 9 Fp-1, Fp-15, Fp-18, Fp-23, Fp-31, Fp-39, Fp-51, Fp-71, Fp-75 Секция Versicolores 30
A. versicolor 21 1 Fv-1 >5
использовать экстракцию при слабощелочных значениях рН (рисунок).
Нами были исследованы 138 культур грибов рода Aspergillus, выделенных из разных местообитаний: почвы различных регионов, арктические многолетнемерзлые грунты, растительное сырье, кожаные изделия. Таксономическое разнообразие выборки представлено 13 видами пяти секций. Виды секций Clavati и Fumigati характеризуются наличием только одноярусных кониди-альных головок, для грибов секций Flavi и Nigri типично формирование как одно-, так и двухъярусных конидиальных головок, иногда даже в пределах одного штамма. Виды секции Versicolores образовывали только двухъярусные структуры.
Проведенные исследования показали, что наиболее активными продуцентами ЦПК являются микромицеты секции Flavi (таблица). У 15 из 18 изученных культур A. oryzae обнаружен этот токсин. Значительный индекс креативности отмечен для вида A
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.