БИООРГАН И ЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 5, с. 396 - 398
. ПИСЬМА __
РЕДАКТОРУ
УДК 577.218
СИНТЕЗ В КЛЕТКАХ Escherichia coli И БЫСТРЫЙ МЕТОД ОЧИСТКИ ВЫСОКОАКТИВНОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ ШбДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ Thermus aquaticus
© 1995 г. Ю. В. Смирнов, А. Ф. Фрадков, О, Г. Чзхмахчева, В. А. Ефимов*
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, i 17871, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16110
Поступило в редакцию 10.11,94 г.
Ключевые слова: полимераза Tag, полимеразная цепная реакция, хроматография металл-хелатная.
Термостабильная ДНК-полимераза Thermus aquaticus (Taq-полимераза) в настоящее время является необходимым инструментом в работах, связанных с амплификацией фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). В связи с этим не ослабевает интерес к совершенствованию методов получения этого фермента в высокоочищенном виде [1 - 3]. В настоящей работе описано клонирование гена Га^-полимеразы, его экспрессия в Е. coli с получением гибридного белка с полигистидиновым доменом и выделение высокоактивного препарата рекомбинантного фермента с помощью аффинной хроматографии.
Ген 7я<?-полимеразы (2496 п. о.) собирали из трех фрагментов, полученных методом ПЦР с использованием ДНК Th. aquaticus [1] И шести синтетических олигодезоксирибонуклеотидов-прай-меров (см. схему). Последовательности двух из них соответствовали 5'- и З'-концам целевого гена (праймеры 1 и 4) и имели сайты эндонуклеаз рестрикции Bgl 11 и £coRI для встраивания гена в экс-прессирующий вектор. Фрагменты I, II и III гена 7'(«/-полимеразы длиной соответственно 627, 1012 и 915 и. о. были получены в трех раздельных ПЦР в условиях, аналогичных описанным в работе [2]. Продукты амплификации разделяли с помощью электрофореза в 1.5% агарозном геле. Фрагмент I обрабатывали эндонуклеазой рестрикции tfmdIII, фрагмент II - HindUl и Pstl, а фрагмент III - Pstl. Полученные при этом дуплексы лигировали последовательно: сначала фрагменты 1 и II, а затем к полученному при этом дуплексу длиной 1602 п. о. присоединяли фрагмент III. Продукт лигирова-ния. соответствующий целому гену (2505 п. о.), обрабатывали рестриктазами Bg/II и EcoRI и встраивали в предварительно расщепленную эти-
* Аптор для переписки.
ми же ферментами плазмиду рТН1, сконструированную нами ранее [4]. В экспрессирующем векторе рТН1 условия транскрипции гена целевого полипептида создаются за счет промоторной области гена 10 бактериофага Т7, а условия трансляции - за счет предшествующего этому гену рибосомсвязывающего участка и стартового триплета, за которым следуют фрагмент, кодирующий гомогистидиновый домен, и полилинкер-ный участок. Введение гена в плазмиду рТН1 между ßg/II- и EcöRI-сайтами обеспечивает сохранение рамки считывания, а продукт его экспрессии содержит на N-конце 11 дополнительных аминокислотных остатков, шесть из которых представляют собой гистидин. Наличие последних должно обеспечивать возможность очистки рекомбинантного белка металл-аффинной хроматографией на Ni-агарозе.
В результате введения гена Гжу-полимеразы в вектор рТН1 была получена плазмида РТНТ1. После трансформации клеток Е. coli BL21(DE3) этой ДНК проводили скрининг колоний гибридизацией с мечеными фрагментами гена Taq-nona-меразы, а затем давшие положительный сигнал клоны проверяли на наличие 7а¿/-полимеразной активности [5]. Клоны, обнаружившие наивысшую активность, использовали для получения биомассы для препаративного выделения фермента.
Выращивание биомассы и лизис клеток проводили в основном так, как описано в работе [2]. После инкубации грубого лизата при 75°С в течение 30 мин и последующего центрифугирования (12000 об/мин, 15 мин, 4°С) супернатант наносили на колонку с Ni-NTA-агарозой (фирма QIAGEN, ФРГ), предварительно промытой буфером, содержащим 10 мМ трис-HCl (pH 7.9), 300 мМ KCl, 0.1% Nonidet Р40, и уравновешенной тем же буфером с добавлением 1 мМ EDTA и 1 мМ фенил-
СИНТЕЗ В КЛЕТКАХ Escherichia coli
397
WmdIII
(.V) GGCGAGGÄÄGCTTCTGGAGGAGTGCCGGAGCC
Wnd III
Схема.
метил сульфоиилфторида (PMSF). После нанесения лизата сорбент промывали буфером, содержащим 20 мМ HEPES (pH 7.9), 300 мМ KCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ PMSF, 0.1% Nonidet Р40. Затем 7'«</-нолимера-зу элюировали тем же буфером с добавлением
1 2 3
'Электрофорез в 10% полиакриламндном гслесЗОЗ белковых фракций при выделении рскомбишштной His6-7ад-полимеразы из клеток Е. coli BL21 (DE3)/pTHTl: / - суммарный клеточный лизат; 2 - фракция белков, не связавшихся с Ni-NTA-агарозой; 3 - гибридный белок после элюции с Ni-NTÄ-агарочы, обладающий высокой 7я<7-полимеразиой активностью; справа указаны молекулярные массы (кДа).
200 мМ имидазола и концентрировали диализом против буфера, содержащего 20 мМ HEPES (pH 7.9), 100 мМ KCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ дитиотре-ит, 0.1% Nonidet Р40, 50% глицерина. В результате подобной очистки из 1 л бактериальной культуры был получен практически гомогенный препарат фермента (см. рисунок) в количестве 0.8 - 1 мг с удельной активностью около 6.5 тыс. ед, акт./мг белка. Активность №56-7д(/-полимеразы определяли так, как описано в работе [5].
Очищенные препараты рекомбииантной His6-Га^-полимеразы обладали хорошей процессивно-стью и эффективно амплифицировали в ПЦР фрагменты ДНК длиной более 2500 - 3000 п. о. Фермент сохранял до 50% полимеразной активности после инкубации в течение 60 мин при 95°С. Н^-Та^-полимераза сохраняла активность на протяжении 30 - 40 циклов ПЦР. Как показало тестирование в условиях работы [6], выделенный нами рекомбинантный фермент был практически свободен от нежелательных примесей белковой природы, в том числе белков, обладающих эн-донуклеазной и 3'-5'-экзонуклеазной активностью. Полученные данные показывают, что введенные аминокислотные замены не ухудшили свойств термостабильной ДНК-полимеразы по сравнению с доступными коммерчески и известными из литературы препаратами фермента [1 - 3J и в то же время существенно облегчили его очистку, сократив ее до одной стадии. Это делает полученный нами штамм Е. coli - продуцент His6-Taq-полимеразы - весьма перспективным для биотехно л огии.
Авторы признательны АЛ. Калинкиной и Н.С. Быстрову за синтез олигодезоксирибонук-леотидов, а также B.C. Артамоновой за участие на отдельных стадиях эксперимента.
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 21 № 5
1995
398
СМИРНОВ и др.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Lawyer F.С., Stoffel S., Saiki R.K., Mvambo К., Dгит-то nd R., Gelfand D.H. II J. Biol. Chem. 1989. V. 264. N° 11. P. 6427 - 6437.
2. Enqelke A.C.. Krikos A.. Bruck M.E., Ginsburg D. // Anal. Biochem. 1990. V. 191. № 2. P. 396 - 400.
3. Патрушев Jl.И., Валяев А.Г., Головченко ПЛ., Виноградов СВ., Чикиндас М.Л., Киселев В.И. //
Молекуляр. биология. 1993. Т. 27. № 5. С. 1100- 1112.
4. Ефимов В.А., Фрадков А.Ф., Калинкина А .Л., Чах-махчева О.Г. // Биоорган, химия. 1995. Т. 21. № 1. С. 11 - 17.
5. Каледин A.C., Слюсаренко А.Г., Городецкий С.И. // Биохимия. 1980. Т. 45. № 4. С. 644 - 651.
6. Каледин A.C., Слюсаренко А.Г., Городецкий С И. // Биохимия. 1982. Т. 47. № 11. С. 1785 - 1791.
Synthesis in Escherichia coli and a Rapid Method of Isolating High-activity Recombinant His6 DNA Polymerase from Thermus aquaticus
Yu. V. Sniirnov, A. F. Fradkov, O. G. Chakhmakhcheva, and V. A. Efimov*
Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117871 Russia
Key words: Taq polymerase, polymerase chain reaction, metal-chelate chromatography.
* To whom correspondence should be addressed.
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 21 №5 1995
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.