МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 377-387
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 57.083.18
СИСТЕМА ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ ГЕНОВ РИБУЛОЗО-1,5-БИСФОСФАТКАРБОКСИЛАЗЫ/ОКСИГЕНАЗЫ У БАКТЕРИЙ РАЗЛИЧНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ГРУПП
© 2004 г. Е. М. Спиридонова*, И. А. Берг*, Т. В. Колганова**, Р. Н. Ивановский*, Б. Б. Кузнецов**, Т. П. Турова*** 1
*Кафедра микробиологии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
**Центр "Биоинженерия" РАН, Москва ***Институт микробиологии РАН, Москва Поступила в редакцию 19.08.03 г.
На основе анализа представленных в ОепБапк нуклеотидных последовательностей генов cbbL и cbbM, кодирующих большую субъединицу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФК), ключевого фермента цикла Кальвина, разработана система праймеров, позволяющая получать ПЦР-фрагменты этих генов длиной около 800 пар оснований для различных фото- и хемотрофных бактерий. Проведение ПЦР с ДНК бактерий, для которых известна первичная структура этих генов и которые принадлежат к различным таксономическим группам, показало эффективность предложенной системы для выявления генов РБФК. Секвенированы и депонированы в ОепБапк последовательности фрагментов генов РБФК бактерий родов AcidithiobacШus, Ectothiorhodospira, MagnetospiriUum, МеЛу-locapsa, Thioalkalispira, Rhodobacter и RhodospiriUum, а также проведен филогенетический анализ транслированных аминокислотных последовательностей этих фрагментов.
Ключевые слова: рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа, cbbL, cbbM, ПЦР, олигонукле-отидные праймеры, филогенетический анализ.
ВВЕДЕНИЕ
Рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксиге-наза (РБФК) является ключевым ферментом ав-тотрофной фиксации С02 в цикле Кальвина. Хотя свойства РБФК были обстоятельно исследованы классическими биохимическими методами [1], данные о происхождении и эволюции этого фермента ограничены [2]. Известно, что автотроф-ные организмы, ассимилирующие С02 через цикл Кальвина, принадлежат к различным и достаточно удаленным друг от друга эволюционным ветвям. Поэтому вопрос о моно- или поли-филетическом происхождении РБФК остается открытым. Для исследования происхождения и эволюции РБФК необходимо использовать моле-кулярно-биологические методы, позволяющие проводить сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей структурных генов, кодирующих этот белок, у различных групп прокариот. В результате сравнения филогенетических схем (деревьев), построенных на основе анализа генов 16S рРНК и РБФК, можно судить об особенностях эволюции и функционирования РБФК у различных прокариот.
1 Автор для переписки (e-mail: ttour@biengi.ac.ru).
Выделяют 4 формы РБФК [2-4]. Форма I состоит из восьми больших (Ь) и восьми малых (Б) субъединиц (гены сЪЪЬ и cbbS соответственно). Большие субъединицы выполняют каталитическую функцию, точная роль малых субъединиц не выяснена. Они не обладают каталитической активностью, но их присутствие значительно увеличивает активность фермента, вероятно, путем стабилизации гексадекамерной формы и конфор-мационных сдвигов в активном центре фермента.
Форма I РБФК подразделяется на два типа: "зеленый" и "красный". Эти два типа различаются по аминокислотному составу больших субъединиц. "Зеленый" тип РБФК присутствует у хло-ропластов наземных растений, зеленых водорослей, цианобактерий, представителей а-, в- и у-протеобактерий. "Красным" типом фермента обладают многие незеленые водоросли и некоторые представители а- и Р-протеобактерий. Для Rhodobacter azotoformans было показано присутствие фермента как "красного", так и "зеленого" типов [5].
Форма II РБФК (ген сЪЪМ) состоит только из больших субъединиц (Ьп), число которых варьирует от двух до восьми в зависимости от организма. Каталитические субъединицы форм I и II значительно различаются и имеют лишь 25-30%
сходства аминокислотных последовательностей [2, 3]. Многие автотрофные бактерии, включая некоторых пурпурных несерных бактерий и тио-бацилл, имеют одновременно и форму I, и форму II РБФК. Несмотря на высокую степень дивергенции аминокислотных последовательностей форм I и II фермента, в них имеются высоко консервативные участки, относящиеся к активному центру. Консервативность важных для катализа аминокислотных остатков обеспечивает единообразие активного центра и трехмерной структуры больших субъединиц всех бактериальных РБфК.
Гены, кодирующие форму III РБФК, были обнаружены у некоторых архебактерий [6]. Было показано, что, по крайней мере, у Methanococcus janaschii этот ген экспрессируется при автотроф-ном росте, а его продукт обладает активностью РБФК [7].
Наконец, ген, кодирующий белок, сходный с РБФК (IV тип), был идентифицирован при секве-нировании генома зеленой серной бактерии Chlo-robium tepidum [4]. Такой же ген был выделен и секвенирован у C. limicola forma thiosulfatophilum. Предполагается, что продукт этого гена играет важную роль в серном метаболизме и ответе на окислительный стресс.
Для определения нуклеотидных последовательностей генов РБФК ранее уже были предложены олигонуклеотидные праймеры, позволяющие амплифицировать фрагменты этих генов. Однако существенным недостатком предложенных ранее праймеров является то, что они были сконструированы для амплификации генов РБФК узких групп прокариот или даже отдельных видов микроорганизмов [4, 5, 8-10]. Это связано, в основном, с тем, что количество существующих данных по первичной структуре генов РБФК прокариот все еще относительно невелико (в сравнении с количеством опубликованных последовательностей генов 16S рРНК и последовательностей генов РБФК растений), что затрудняет подбор достаточно универсальных праймеров.
Целью данной работы было конструирование и тестирование максимально универсальной системы праймеров, позволяющей амплифицировать участки генов РБФК, пригодные для использования в филогенетическом анализе, для таксономически как можно более широкого спектра бактерий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследований. Объектами исследования были штаммы микроорганизмов из коллекций каф. микробиологии МГУ и различных лабораторий Института микробиологии РАН (Москва), а также Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино), Астра-
ханского государственного технического университета и Центра "Биоинженерия" РАН (Москва) (табл. 1).
Выделение ДНК. Выделение ДНК проводили согласно ранее разработанной методике [11]. Полученные препараты ДНК имели концентрацию 10-60 мкг/мл. РНК в препаратах присутствовала в следовых количествах (по электрофоретичес-ким данным, менее 1%).
Выбор праймеров. Поиск нуклеотидных последовательностей генов РБФК прокариот различных таксономических групп был проведен в международном банке данных GenBank. Процедуры выравнивания нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы CLUSTALW v 1.75. Построение консенсусной последовательности и поиск в ней консервативных участков осуществляли с помощью специально разработанной компьютерной программы (разработка Марусиной А.И., центр "Биоинженерия" РАН, 2001, неопубликованные данные).
Оптимизация условий ПЦР для амплификации выбранных участков генов РБФК. Для уменьшения количества неспецифических фрагментов и получения нужного фрагмента в повышенной концентрации, условия ПЦР были оптимизированы по методу Тагучи [12].
Амплификация участков генов РБФК. Амплификацию проводили с использованием сконструированных праймеров на приборе Cetus 480 ("Perkin Elmers", Швеция) с применением термостабильной полимеразы BioTaq ("Диалат ЛТД", Москва) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Температурно-временные профили ПЦР представлены в табл. 2. Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 1%-ном геле агарозы. Документирование результатов электрофоретического анализа проводили на установке гель-документации BioDoc II ("Biometra", Германия). Выделение и очистку фрагментов из легкоплавкой агарозы проводили с использованием набора "Wizard PCR Preps" фирмы "Promega" согласно рекомендациям производителя.
Секвенирование проводили по методу Сэнгера с использованием набора Silver Sequencing ("Promega", США) согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями. Электрофорез проводили на приборах Macro-phore, "Pharmacia" (Швеция) и SQ3 Sequencer, "Hoefer" (США), при толщине полиакриламидно-го геля 0.19 мм. Для секвенирования в двух направлениях применяли разработанные прямые и обратные праймеры.
Филогенетический анализ исследуемых последовательностей. Первичный сравнительный анализ полученных de novo последовательностей с последовательностями из базы данных GenBank проводили с помощью программы NCBI BLAST
Таблица 1. Исследуемые организмы и выявление у них различных форм и типов генов РБФК
ген cbbL ген cbbL ген cbbM формы II РБФК
OpraHH3M Штамм "зеленого" типа формы I РБФК "красного" типа формы I РБФК Источник
Acidithiobacillus ferrooxidans TFY + - + ИНМИ РАН, Москва
Rhodobacter capsulatus B-10 + - + МГУ, каф. микробиологии
Rhodobacter sphaeroides 2R - + + МГУ, каф. микробиологии
Rhodospirillum rubrum 1R - - + МГУ, каф. микробиологии
Phaeospirillum fulvum 5K + - + МГУ, каф. микробиологии
Chloroflexus aurantiacus B3 - - - МГУ, каф. микробиологии
Chloroflexus aurantiacus OK-70 - - - МГУ, каф. микробиологии
Chloroflexus sp. Andorra - - - МГУ, каф. микробиологии
Ectothiorhodospira shaposhnikovii 1 + - + МГУ, каф. микробиологии
Ectothiorhodospira mobilis 8115 + - + МГУ, каф. микробиологии
Heliobacterium sulfidophilum BR-4 - - - ИНМИ РАН, Москва
Heliorestis baculata OS-H1 - - - ИНМИ РАН, Москва
Methylobacter modestohalophilus 10S - - - ИБФМ, Пущино
Methylobacter alcaliphilus 20Z - - - ИБФМ, Пущино
Methylocystis puriformis 62 - - - ИНМИ РАН, Москва
Methylocystis puriformis 79 - - - ИНМИ РАН, Москва
Methylocapsa acidiphila B2 - + - ИНМИ РАН, Москва
Methylocella palustris K2a - - - ИНМИ РАН, Москва
Methylosinus trichosporium 5 - - - ИНМИ РАН, Москва
Methylocystis echinoides 2 - - - ИНМИ РАН, Москва
Beggiatoa sp. D402 - + но ИНМИ РАН, Москва
Beggiatoa sp. D405 - - - ИНМИ РАН, Москва
Beggiatoa alba DSM 1416 -
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.