РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2011, том 5(14), № 3-4, с. 215-227
= ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ =
СИСТЕМНАЯ КРАСНАЯ ВОЛЧАНКА: МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ ЛЕГКИЕ ЦЕПИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ПРОТИВ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА ОБЛАДАЮТ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ И ДНКазной АКТИВНОСТЬЮ
© 2011 г. А.М. Безуглова*, В.Н. Бунева***, Г.А. Невинский*'**
*Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, Россия;
**Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия
Поступила: 05.09.2011. Принята: 07.10.2011
Ранее было показано, что в отличие от здоровых доноров кровь больных рассеянным склерозом (РС) содержит 1дС, 1дА и 1дМ антитела (АТ), которые эффективно и специфично ги-дролизуют основной белок миелина (ОБМ). С помощью ИФА в данной работе впервые показано, что содержание АТ против ОБМ в крови больных системной красной волчанкой (СКВ) в среднем в 2,1 раза ниже, чем у больных РС, но в 4,2 раза выше, чем у здоровых доноров. Поликлональные 1дС антитела из крови больных СКВ, как и пациентов с РС, эффективно гидролизуют ОБМ. Для получения моноклональных абзимов была использована библиотека кДНК легких цепей (к-типа) АТ больных СКВ и метод фагового дисплея. Были получены препараты моноклональных легких цепей (МЛЦ), эффективно гидролизующие ОБМ. Один из препаратов МЛЦ эффективно гидролизовал не только ОБМ, но и ДНК. Обсуждаются причины возможности образования абзимов с несколькими различными каталитическими функциями.
Ключевые слова: системная красная волчанка, поликлональные и моноклональные абзи-мы, гидролиз основного белка миелина, гидролиз ДНК
ВВЕДЕНИЕ
Искусственные антитела (АТ) против стабильных аналогов переходных состояний химических реакций, а также природные иммуноглобулины с каталитическими активностями были названы абзимами и достаточно хорошо описаны в литературе (для обзора см. [1—7]). К настоящему времени описаны поликлональные 1дС и/или 1дА, 1дМ, гидролизующие ДНК, РНК [9 — 20] и полисахариды [21 — 25], выделенные из крови пациентов с аутоиммунными заболеваниями (АИЗ): СКВ [9—12, 16], аутоиммунным тиреоидитом [13], полиартритом [13], рассеянным склерозом (РС) [14], сахарным диабетом [19], лим-
Адрес: 630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8. Институт химической биологии и фундаментальной медицины. E-mail: nevinsky@niboch.nsc.ru
фопролиферативными заболеваниями [16], а также вирусным гепатитом [15], СПИДом [17—18] и рядом заболеваний, связанных с бактериальными инфекциями [20]. Описаны поликлональные абзимы, гидролизующие ау-тоантигенные белки — тиреоглобулин (аутоиммунный тиреоидит и ревматоидный артрит) [26, 27], белковый фактор VIII (гемофилия) [28] и основной белок миелина (РС; антитела IgG, IgM и IgA) [29 — 31], а также вирусные — обратную транскриптазу и интегразу и человеческие — казеин и сывороточный альбумин при ВИЧ-инфекции [32 — 33].
Кроме того, в литературе описаны полученные с помощью гибридомной технологии мо-ноклональные мышиные АТ, гидролизующие интестинальный вазоактивный нейропептид (VIP) [34], ДНК [35, 36] и уреазу (H. pylori) [37].
Особенностью структурной организации абзимов является то, что их каталитические центры чаще всего расположены на легких цепях 1дС, 1дА и 1дМ антител, которые обычно имеют относительно низкое сродство, а тяжелые цепи ответственны за узнавание и проявляют к субстратам более высокое сродство (для обзора см. [1 — 7]). Тем не менее вклад легкой и тяжелой цепей в формирование активных центров абзимов с ДНК-, РНК-, нуклеотид- и полисахарид-гидролизующей активностями может существенно отличаться. Например, АТ-зависимый гидролиз ДНК и РНК изолированными легкими цепями р1дС из крови больных с СКВ, РС и другими АИЗ, а также из крови больных аутоиммунных мышей (MRL-lpr/lpr) намного более эффективен, чем интактными АТ [6, 7, 10, 11, 38 — 40]. Подобная ситуация обнаружена в случае ДНК- и РНК- гидролизующих 1дСв и в1дА из материнского молока [41, 42]. В то же время обнаружены моноклональные 1дС MRL-lpr/ 1рг мышей, активный центр которых расположен на стыке легких и тяжелых цепей; при этом после разделения как легкие, так и тяжелые цепи активны в гидролизе ДНК [36]. Обе, легкая и тяжелая цепь р1дС антител из крови MRL-lpr/lpr мышей, активны в гидролизе полисахаридов [43]. Разделенные легкие и тяжелые цепи АТР-гидролизующих pIgG из материнского молока не активны; гидролиз АТР катализируют только интактные 1дСв (Н^2) и их частично восстановленные олигомерные формы, Н^ и HL, что свидетельствует об участии формирования активных центров этих абзимов цепей обоих типов [44].' В то же время и легкие, и тяжелые цепи pIgGs из крови MRL-lpr/lpr мышей каталитически активны по отдельности в реакции гидролиза различных №ГР, МБР, NMP и dNMP [45].
Изолированные легкие цепи поликлональ-ных АТ также активны в гидролизе пептидов и белков [1 — 7]. С помощью библиотек кДНК, кодирующих легкие цепи, и метода фагового дисплея были получены препараты легких цепей АТ, гидролизующие У1Р [46, 47], протромбин [48, 49], gp120 белок оболочки вируса иммунодефицита человека [50].
Особенностью канонических ферментов является то, что они катализируют обычно только одну химическую реакцию. Например, ДНКазы гидролизуют только ДНК, но не РНК, а РНКазы только РНК, но не ДНК. Каталитическая полиреактивность была впервые обнаружена у мышиных моноклональных IgG
антител. Было показано, что моноклональные IgG против различных последовательностей ДНК гидролизуют РНК в 30—100 раз быстрее, чем ДНК [51]. Кроме того, недавно было показано, что один из препаратов моноклональных АТ против вируса мозаики огурцов (CMV) обладает протеолитической, ДНКазной и РНКазной активностями [52]. Это достаточно необычное и неожиданное явление для каталитически активных белков. В то же время такие АТ против вирусных частиц могут быть АТ против ДНК или РНК в комплексе с белками оболочки вируса, когда в антигенную детерминанту включены фрагменты белка и нуклеиновой кислоты. Это может привести к формированию активного центра, содержащего структурные элементы, подобные таковым у канонических протеаз и нуклеаз. В литературе пока не известно природных АТ человека и млекопитающих против нуклеиновых кислот (или белков), которые обладали бы способностью гидролизовать как белки, так и нуклеиновые кислоты.
В данной работе с помощью библиотеки кДНК легких цепей АТ больных СКВ и фагового дисплея получены моноклональные легкие цепи иммуноглобулинов против основного белка миелина и исследована их активность в гидролизе ДНК и ОБМ. Один из препаратов моноклональных легких цепей против ОБМ эффективно гидролизовал как ОБМ, так и ДНК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали акриламид, N,N'-метиленбисакриламид, глицин, тритон Х-100, бромфеноловый синий, ТЕМЕД (Fluka, Швейцария), SDS (Merck, Германия), Трис (НеНсоп, Россия), высокоочищенный ОБМ человека (>95%) (RCMDT, Москва).
Электрофоретически и иммунологически гомогенные препараты IgG из плазмы крови больных РС, СКВ и здоровых доноров получали с помощью последовательных аффинных хроматографий на Protein G-Sepharose и на Protein A-Sepharose согласно [29 — 31]. Элек-трофоретический анализ белка проводили с помощью метода Леммли в 12% или в 4—15% градиентном гелях; окраску проводили серебром или кумасси R-250 [29 — 31].
ИФА содержания АТ против ОБМ в крови больных СКВ проводили по описанной ранее методике с использованием коньюгатов АТ с пероксидазой хрена [29 — 31]. Относительное содержание анти-ОБМ АТ исследуемых
образцов было выражено в единицах оптического поглощения окрашенного продукта реакции при 450 нм (ед. OD450; среднее 3-х измерений).
Амплификация фаговой библиотеки
В работе использована фаговая библиотека кДНК легких цепей к-типа больных СКВ, ,описанная ранее [53]. Амплификацию фага VCSM13 и определение его титра проводили согласно [53]. Для амплификации фаговой библиотеки 500 мкл ночной культуры E. coli штамма TG1 помещали в колбу, содержащую 50 мл 2yTL среды, смесь инкубировали на качалке при 37 оС до OD600 =0,6 — 0,8. К 5 мл этой смеси добавляли 100 мкл (109 фаговых частиц) из фаговой библиотеки и инкубировали 30 мин при 37о С без перемешивания, затем 1 ч с перемешиванием. К полученной смеси добавляли 90 мл 2yTL среды с ампициллином (50 мкг/мл), клетки растили 1 ч с перемешиванием.
К полученной смеси добавляли 10 мл фага VCSM13 (1011 фаговых частиц) и инкубировали при 37 оС в течение 30 мин без перемешивания, затем 1 ч с перемешиванием. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 4000 об/мин при комнатной температуре и ресуспендировали осадок в 100 мл 2yTL среды, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл). Клетки растили в течение ночи.
Затем клетки осаждали центрифугированием (1000 об/мин, 10 мин). К супернатанту добавляли 1/5 объёма 20 % раствора PEG-8000, содержащего 2,5 M NaCl, инкубировали во льду несколько часов и центрифугировали (104 об/мин, 30 мин). Осадок ресуспендирова-ли в 1 мл 10 мМ трис-HCl, рН 7,5 и центрифугировали (12 000 об/мин, 5 мин). К супернатанту добавляли 1/5 объема PEG/NaCl (20 % PEG в 2,5 М NaCl), инкубировали во льду несколько часов и центрифугировали (12000 об/ мин, 5 мин). Осадок ресуспендировали в 4 мл 10 мМ трис-HCl, рН 7,5. Определяли титр фаговой библиотеки.
Фракционирование фаговых частиц на ОБМ-сефарозе
Препарат фаговых частиц (4 мл, 1014 фаговых частиц) наносили на колонку с ОБМ-сефарозой (3 мл), предварительно уравновешенную 10 мМ трис-HCl, pH 7,5. Элюцию не связавшихся с сорбентом компонентов
среды для выращивания фаговых частиц проводили 10 мМ трис-HCl буфером, pH 7,5. Специфическую элюцию фаговых частиц с ОБМ-сефарозы проводили 10 мМ трис-HCl буфером, pH 7,5, содержащим: 0,01; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; NaCl, 1; 2; 3 M KCl и 50 мМ трис-глицин буфером, pH 2,6. Полученные фракции концентрировали, после чего фаговые частицы осадили с помощью PEG/NaCl, как описано выше.
Получение моноклональныхлегких цепей
200 мкл ночной культуры E. coli штамма HB2151 помещали в колбу, содержащую 80 мл 2yTL среды, смесь инкубировали на качалке при 37оС до OD600 = 1,0. Клетки центрифуги
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.