научная статья по теме СКРИНИНГ ПРОДУЦЕНТОВ ПРОТЕИНАЗ С ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ И КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЯМИ СРЕДИ МИКРОМИЦЕТОВ Биология

Текст научной статьи на тему «СКРИНИНГ ПРОДУЦЕНТОВ ПРОТЕИНАЗ С ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ И КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЯМИ СРЕДИ МИКРОМИЦЕТОВ»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 3, с. 316-322

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 579.222.3:577.152.34

СКРИНИНГ ПРОДУЦЕНТОВ ПРОТЕИНАЗ С ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ И КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЯМИ СРЕДИ МИКРОМИЦЕТОВ

© 2015 г. Т. С. Шаркова*, А. В. Кураков*, А. А. Осмоловский*, 1, Э. О. Матвеева*, В. Г. Крейер*, Н. А. Баранова*, Н. С. Егоров**

*Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

**Международный биотехнологический центр Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 22.07.2014 г.

Проведен скрининг продуцентов протеиназ с фибринолитической (плазминоподобной и активатор-ной к плазминогену) и коллагенолитической активностями среди 83 штаммов микроскопических грибов разных экологических групп. Энтомопатогенные микромицеты, по сравнению с сапротрофами, потенциальными фитопатогенами и эпифитами секретировали протеиназы с более высокой фибринолитической и коллагенолитической активностью. Выявлены штаммы микромицетов, протеолитиче-ские ферменты которых обладали коллагеназной активностью и штаммы-продуценты протеиназ с плазминоподобной активностью. Среди исследованных микромицетов не было обнаружено штаммов, способных секретировать протеиназы только с активаторной к плазминогену активностью. Найден продуцент внеклеточных протеиназ с высокой активаторной к плазминогену, плазминоподобной и коллагенолитической активностями — То1урос1а^ыт тАаШт к1. Показано, что удельная актива-торная к плазминогену активность Т. тАаШт к1 на 20% выше плазминоподобной активности.

Ключевые слова: внеклеточные протеиназы микромицетов, коллагеназы, фибринолитические ферменты, протеиназы — активаторы плазминогена.

DOI: 10.7868/S0026365615030180

Потребность в протеиназах, активных в отношении фибрина и коллагена, остается актуальной уже на протяжении многих лет. Коллагеназы входят в состав препаратов для очищения от некротизиро-ванных тканей и гнойных выделений в раневых полостях [1, 2]. Фибринолитические ферменты необходимы для создания новых эффективных тром-болитических препаратов. Однако многие тромболитики, напрямую гидролизующие фибрин, вызывают серьезные осложнения — кровотечениия и ретромбозы [3, 4]. Более перспективными могут оказаться ферменты, предотвращающие образование и осуществляющие лизис фибринового сгустка через активацию белка плазминогена — предшественника плазмина, естественного фибринолити-ческого фермента системы гемостаза [5, 6]. Подобные ферменты могут продуцировать некоторые микромицеты, протеиназы которых, в отличие от бактериальных протеиназ, обладают более узкой субстратной специфичностью [6].

В процессе роста микроскопические грибы образуют широкий спектр ферментов, в том числе и

1 Автор для корреспонденции (e-mail: aosmol@mail.ru).

протеиназы, которые способны гидролизовать разнообразные белковые субстраты, в том числе такие нерастворимые в воде белки как фибрин и коллаген [1, 2, 7—9]. К микромицетам — продуцентам таких протеиназ относятся представители классов Dothideomycetes, Eurotiomycetes, Leothiomycetes, Orbil-iomycetes, Sordaryomycetes (отдел Ascomycota) и Zygomycetes (отдел Zygomycota), составляющие значительную часть почвенных сапротрофов, паразитов растений и насекомых.

Протеиназы, осуществляющие ограниченный протеолиз плазминогена, продуцируют микроскопические грибы Trichothecium roseum и Arthrobotrys longa, и на их основе созданы тромболитические препараты активаторов плазминогена — триаза и лонголитин [10].

В связи с недостатками существующих препаратов фибринолитического (прямого фибри-нолиза и активаторов плазминогена) и коллаге-нолитического действия — широкой субстратной специфичностью, токсичностью, подавлением активности ингибиторами крови — продолжаются поиски грибных продуцентов необходимых протеиназ. Известные грибные протеина-

зы, эффективно расщепляющие коллаген и фибрин, как правило, гидролизуют и многие другие белки [1-6, 8, 9].

Спектр и свойства протеиназ, синтезируемых микроскопическими грибами существенно варьируют не только в зависимости от таксономического положения организма, но и принадлежности видов или штаммов к конкретной экологической группе [5, 6]. Поэтому важно представлять особенности ферментативной активности и субстратную специфичность протеиназ у микроми-цетов разных экологических групп.

Целью работы был скрининг продуцентов протеиназ с выраженной активаторной к плазми-ногену, прямой фибринолитической или коллаге-нолитической активностью среди микроскопических грибов разных таксономических и экологических групп.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микромицеты и их культивирование. Объектами исследований служили микромицеты из коллекции кафедры микологии и альгологии МГУ имени М.В. Ломоносова, а также выделенные в чистую культуру из различных экотопов (почв, растительных остатков, поверхности растений, насекомых) методами посева разведений или нанесения мелкозема или небольших частиц тела насекомых (1-3 мм) на поверхность твердых сред (Сабуро, сусло- или Чапек-агар) [11]. Описание культурально-морфологических признаков и идентификацию чистых культур осуществляли согласно рекомендуемым для каждой группы микромицетов определителям [12, 13].

Штаммы выращивали в глубинных условиях на орбитальных качалках (200 об/мин) в колбах объемом 750 мл со 100 мл питательной среды при 28°С. Посевной материал получали смывом спор микромицетов с агаризованной среды Чапека в среду, содержащую сусло, глюкозу и пептон [14], с дальнейшим культивированием в течение 2 сут. По истечении этого периода культивирования посевной материал в объеме 3 мл переносили в среды культивирования — органо-минеральную (среда № 1) и минеральную (среда № 2) по содержанию азота, и культивировали в течение 4 сут. Среда № 1 имела состав (в г/л): глюкоза — 30.0, глицерин — 70.0, гидролизат рыбной муки — 5.0, NaNO3 — 2.0, KH2PO4 — 0.5, MgSO4 — 0.5; среда № 2 (в г/л): глюкоза — 35.0, крахмал — 10.0, NH4NO3 — 5.0, NaCl — 2.0, KH2PO4 — 0.5, MgSO4 — 0.5.

Определение протеолитической активности.

Активность протеолитических ферментов определяли в культуральной жидкости после ее отделения от мицелия фильтрованием через фильтровальную бумагу марки "ФС" (Россия). В случае микроконидиальных форм микромицетов филь-

трование производили через фильтры "Millipore" (США) с диаметром пор 0.45 мкм.

Плазминоподобную активность (на прогретых фибриновых пластинах) и активность активаторов плазминогена (на непрогретых фибриновых пластинах) штаммов определяли по модифицированному методу Аструпа—Мюллертца—Лансе-на и выражали в условных единицах на 1 мл куль-туральной жидкости [15]. Для приготовления фибриновой пластины в чашке Петри смешивали 9 мл 0.76%-ного раствора фибриногена и 0.2 мл 0.4%-ного раствора тромбина, приготовленных на смеси физиологического раствора и 0.05 М трис-HCl буфера (рН 8.2) в соотношении 9 : 1. Инкубацию фибриновых пластин с нанесенными образцами фильтрата культуральной жидкости микромицетов (30 мкл) проводили в течение 6 ч при 37°С.

Коллагенолитическую активность штаммов на стадии первичного скрининга определяли качественно с помощью фотопластин с желатиновым напылением модифицированным методом Чьюнга [16]. На пластины накладывали диски из фильтровальной бумаги диаметром 0.5 см, пропитанные фильтратом культуральной жидкости, и инкубировали при 37°С в насыщенной водными парами камере в течении 4 ч. После этого диски осторожно смывали проточной водой и фиксировали наличие или отсутствие зон лизиса желатины.

Количественное определение коллагенолити-ческой активности грибов проводили по общепринятой методике с незначительными изменениями с использованием азоколла [17]. К 250 мкл фильтрата культуральной жидкости добавляли 500 мкл суспензии азоколла ("Calbiochem", США (2 мг/мл в 0.05 М трис-НС1-буфера, рН 8.2)). Смесь инкубировали на водяной бане в течение 15 мин при 37°С, а затем останавливали реакцию добавлением 750 мкл 10%-ным раствором три-хлоруксусной кислоты (ТХУ). Пробы центрифугировали при 8500 g в течение 5 мин и измеряли оптическую плотность супернатанта при 519 нм. Реакцию проводили при постоянном перемешивании в термошейкере TS-100 ("BioSan", Латвия). Измерение оптической плотности растворов проводили на спектрофотометре Hitachi 200-20 (Япония). Для расчета коллагенолитической активности строили калибровочную кривую по азоколлу, расщепляя проназой Е (1 мг/мл, "Sigma-Aldrich", США) точные навески азоколла до их полного гидролиза. График строили в виде зависимости поглощения высвободившегося при гидролизе азоколла красящего вещества от его концентрации. За единицу активности (ЕАзк) принимали количество мкг расщепившегося азоколла за 1 мин.

Биомассу грибов определяли после отделения фильтрованием и высушивания при 86°С до по-

стоянной массы и рассчитывали в мг на 1 мл среды культивирования.

Повторность опытов трехкратная, приведенные результаты представляют собой средние значения, ошибка которых не превышала 5—7%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Образование протеиназ было изучено у 83 штаммов микроскопических грибов — представителей 23 родов отделаAscomycota (Acremonium, Alternaría, Arthrobotrys, Aspergillus, Beauveria, Chaetomium, Cladosporium, Clonostachys, Doratomyces Eurotium, Fusarium, Gliocladium, Humicola, Lecanicillium, Neosartoria, Oidiodendron, Paecilomyces, Penicillium, Pochonia, Talaromyces, Tolypocladium, Trichotheci-um, Ulocladium) и 4 родов отдела Zygomycota (Ab-sidia, Cunningamella, Mucor, Umbelopsis). Изученные штаммы представляли виды эпифитных и потенциально фитопатогенных (родов Alternaria, Fusarium, Cladosporium), энтомопатогенных (родов Beauveria, Lecanicillium, Paecilomyces, Pochonia, Tolypocladium), нематофаговых (рода Arthrobotrys) и сапротрофных грибов, обитателей минеральных горизонтов почв и разлагающихся органических остатков (родов Aspergillus, Chaetomium, Doratomyces, Penicillium и других из вышеперечисленных) [13].

Протеолитическую активность по отношению к исследуемым субстратам проявили 47 из 83 штаммов микромицетов из разных экологических групп. Данные по фибринолитической и коллагеноли-т

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком