БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 3, с. 408 - 416
УДК 577.151
СМЕНА КИНЕТИЧЕСКОГО РЕЖИМА АГРЕГАЦИИ БЕЛКОВ ПРИ ПОВЫШЕНИИ ТЕМПЕРАТУРЫ. ТЕПЛОВАЯ АГРЕГАЦИЯ КРЕАТИНКИНАЗЫ ИЗ СКЕЛЕТНЫХ
МЫШЦ КРОЛИКА
© 2006 г. Н.В. Федуркина1*, Л.В. Белоусова2, Л.Г. Мицкевич1, Х.-М. Жоу3, З. Чанг4, Б.И. Курганов1
1 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский пр., 33, факс: (495)954-2732, электронная почта: fedurkina@inbi.ras.ru
2 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва; электронная почта: anton@protein.bio.msu.su
3 Department of Biological Science and Biotechnology, Tsinghua University, Beijing 100084, China;
E-mail: zhm-dbs@mail.tsinghua.edu.cn 4 School of Life Science, Peking University, Beiging 100871, China, E-mail: chang@pku.edu.cn
Поступила в редакцию 08.04.05 После доработки 24.05.05
Кинетика агрегации креатинкиназы изучена в 30 мМ буфере Hepes-NaOH, pH 8,0, при 50,6 и 60°. За кинетикой агрегации следили по увеличению кажущегося поглощения (А) при 400 нм. Установлено, что предельное значение кажущегося поглощения (Alim) прямо пропорционально концентрации белка при обеих температурах. Константа скорости реакции первого порядка не зависит от концентрации белка в диапазоне 0,05—0,2 мг/мл при 50,6° и растет при увеличении концентрации белка в интервале 0,1—0,4 мг/мл при 60°. Кинетические кривые, представленные в координатах {A/Am t}, в опытах при 50,6° сливаются в одну общую кривую. Эта кривая совпадает с теоретической кривой денатурации креатинкиназы, построенной с использованием константы скорости денатурации, определенной из данных по дифференциальной сканирующей калориметрии. При 60° время полупревращения для кинетических кривых агрегации уменьшается при увеличении концентрации белка. Сделан вывод, что увеличение температуры от 50,6 до 60° приводит к смене кинетического режима тепловой агрегации креатинкиназы: при 50,6° скорость агрегации лимитируется стадией денатурации белковой молекулы, а при 60° — стадией роста агрегата белка, которая протекает как реакция псевдопервого порядка. Малый белок теплового шока Hsp 16.3 Mycobacterium tuberculosis подавляет агрегацию креатинкиназы.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: креатинкиназа, тепловая агрегация, кинетика, малый белок теплового шока Hsp 16.3.
Белковые агрегаты образуются в результате взаимодействий полностью или частично развернутых белковых молекул, приводящих к образованию агломератов произвольной формы [1—9]. В нормальном физиологическом состоянии клеток белковые агрегаты не накапливаются из-за существования внутриклеточного механизма «контроля» качества белков, который осуществляется при совместном действии ша-перонов и протеиназ [4, 5, 8, 9]. Когда образование неправильно свернутых белков превышает способность клетки их деградировать, происходит образование нерастворимых внутриклеточных комплексов и телец включения, которое ле-
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
жит в основе патогенеза многочисленных дегенеративных и нейродегенеративных заболеваний у человека [3—7]. Поэтому исследование макроскопической агрегации белков является одним из актуальных направлений в современной биологии [3—5].
В качестве объектов для исследования тепловой агрегации часто используют цитратсинте-тазу и малатдегидрогеназу митохондрий, р-кристаллины, алкогольдегидрогеназу и ряд других белков [3, 4]. Креатинкиназа (КК) как объект изучения процесса тепловой денатурации и агрегации исследовалась очень мало [10—15]. Кинетика тепловой агрегации КК в широком диапазоне концентраций белка при разных температурах ранее не изучалась. Фермент широко
распространен в клетке; он находится в большом количестве в цитоплазме, в митохондриях, в саркоплазматическом ретикулуме мышечной, мозговой, сердечной и других тканей. КК выполняет роль «энергетического буфера», катализируя реакцию обратимого переноса фосфо-рильной группы между ATP и креатином с образованием ADP и креатинфосфата, который запасается в клетке, а затем используется ею посредством регенерации ATP в периоды высокой клеточной активности [16, 17]. Фермент был обнаружен в клетке в виде цитоплазматических изоферментов, представляющих собой парные комбинации одинаковых (ММ, ВВ) или разных (МВ) субъединиц [16, 18] и двух митохондриаль-ных изоферментов [19]. Впервые КК была выделена в гомогенном состоянии из скелетных мышц кролика [20, 21], и ее физико-химические свойства интенсивно исследовались [16, 17]. Рентгеноструктурный анализ КК из мышц кролика [22], так же как и митохондриальной креа-тинкиназы [23], показал, что каждая субъединица КК состоит из двух доменов: малого (1—112) и большого (113—380), в щели между которыми расположен активный центр. Связь субъединиц в димере по двум контактным участкам осуществляется восемью водородными связями и одним солевым мостиком [22]. Несмотря на такое небольшое число взаимодействий, связь между субъединицами чрезвычайно прочная, диссоциация димеров на мономеры происходит в жестких условиях (8 М мочевина) и сопровождается частичным разворачиванием мономеров [22, 24, 25]. Интересно отметить, что при нагревании КК происходит разворачивание белковой глобулы без предварительной диссоциации димера на мономеры [10, 11]. Процесс тепловой денатурации КК одностадийный: М2 (нативная) ^ 2 М (денатурированная) [11].
Уже в ранних работах было показано, что креатинкиназа достаточно стабильна в диапазоне физиологических температур (0—40°) и что ее активность практически не меняется при прогревании фермента в течение 30 мин. Даже при 45° он сохраняет ~90% активности. Однако дальнейшее повышение температуры приводит к быстрой потере активности КК и при 53—55° фермент полностью инактивируется [10, 16]. При изучении денатурации КК методом дифференциальной сканирующей калориметрии было показано, что при нагревании фермента со скоростью 1 К/мин избыточная теплоемкость достигает максимума при 56° [11].
В настоящей работе изучена кинетика тепловой агрегации креатинкиназы из мышц кролика в широком диапазоне концентраций белка при температурах 50,6 и 60°, что соответствует
начальному этапу разворачивания белковой молекулы и практически полностью развернутому ее состоянию. Исследовано также влияние на этот процесс малого белка теплового шока Hsp 16.3 Mycobacterium tuberculosis, свойства которого достаточно хорошо изучены [26—31]. Показано, что этот шаперон представляет собой девяти-субъединичный олигомер, обладающий способностью к быстрой динамической диссоциации — реассоциации [27]. Чрезвычайно интересен тот факт, что нагревание шаперона от 25 до 65° приводит к диссоциации нонамера. При этом чем выше температура, тем выше степень диссоциации нонамера на олигомеры с меньшей молекулярной массой. Считается, что диссоциация олигомеров Hsp 16.3 на субъединицы — необходимое условие высвобождения субстратсвязы-вающих центров и проявления шаперонной активности [29, 30].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Креатинкиназу из мышц кролика получали методом Кьюби и др. [20, 21] с последующей хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [32]. Фермент получали в лиофилизированном состоянии и хранили при —20°. Белок был гомогенен по критериям градиентного электрофореза в ПААГ в присутствии Ds-Na. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически, использовав коэффициент поглощения А2 80м 0,88 (мг/мл)-1 [33]. Для расчета молярной концентрации креатинкиназы использовали относительную молекулярную массу димера (85 964 Да), определенную методом масс-спектрометрии [34].
Кинетику агрегации фермента изучали с использованием спектрофотометра Hitachi-557 («Hitachi», Япония), соединенного с IBM-совместимым компьютером, в термостатируемых кюветах с длиной оптического пути 1 см (регистрировали кажущееся поглощение света, проходящего через раствор). Измерения проводили при длине волны 400 нм, при которой нативный белок не поглощает. Процесс агрегации белка изучали в 30 мМ буфере Hepes-NaOH, рН 8,0, который предварительно нагревали до нужной температуры. Затем добавляли аликвоты раствора фермента (5-50 мкл), диализованного против того же буфера. Все операции проводили под постоянным контролем температуры раствора в кювете спектрофотометра с помощью термопары.
Малый белок теплового шока M. tuberculosis Hsp16.3 получали методом Чанга и др. [26] в виде лиофилизированного порошка и хранили при -20°. В опытах использовали препарат белка, растворенного и отдиализованного в 30 мМ
буфере Hepes-NaOH, рН 8,0. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при 280 нм, использовав коэффициент поглощения ^280 0,2 (мг/мл)—1. Для расчета молярной концентрации шаперона использовали молекулярную массу мономера (16 100 Да), определенную методом масс-спектрометрии [26].
Математическую обработку данных кинетики агрегации проводили с использованием программ Origin 7,0 (Microcal Software, Inc. США) и Scientist (MicroMath, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Кинетику агрегации креатинкиназы при 50,6°
изучали в 30 мМ буфере Hepes-NaOH, pH 8,0, в интервале концентраций белка 0,05-0,2 мг/мл. На рис. 1 представлены типичные кинетические кривые увеличения кажущегося оптического поглощения при 400 нм (А400). Каждая кривая представляет собой усредненную кривую из 2-4 параллельных измерений. Анализ кинетических кривых проводили для завершающей стадии процесса агрегации с помощью программы Scientist при допущении, что кажущееся оптическое поглощение пропорционально количеству агрегированного белка. Для определения кинетических параметров использовали уравне-
Рис. 1. Кинетика тепловой агрегации креатинкиназы при 50,6°. Кинетика агрегации регистрировалась при концентрациях белка 0,05 (1), 0,1 (2), 0,125 (3), 0,15 (4), и 0,2 (5) мг/мл. Точки — экспериментальные данные; сплошные линии — теоретические кривые, построенные на основании уравнения (2); штриховые — предельные значения А400 (Ацщ), рассчитанные по уравнению (2)
ние, полученное при рассмотрении агрегации белка как реакции «-го порядка:
dA/dt = к«(Лш - Л)п, (1)
где t — время, Л — Л400 в момент времени t, Alim — предельное значение А при t ^ ю, kn — константа скорости реакции «-го порядка, п — порядок скорос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.