МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 5, с. 546-552
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
СНИЖЕНИЕ АКТИВНОСТИ И ИЗМЕНЕНИЕ СТРУКТУРЫ МЕТАНОТРОФНОГО СООБЩЕСТВА ВЕРХОВОГО БОЛОТА В РЕЗУЛЬТАТЕ ПОЖАРА © 2015 г. О. В. Данилова, С Э. Белова, И. С. Куличевская, С. Н. Дедыш*
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 24.03.2015 г.
На примере торфяных массивов верхового болота Тасин Борское, Владимирская область, пострадавших от пожара 2007 года, проведена оценка нарушений в функционировании сообществ мета-нотрофных бактерий, играющих ключевую роль в контроле эмиссии метана. Потенциальная активность метанокисляющего "фильтра" выгоревших локусов торфяника и численность слагающих его метанотрофных бактерий была существенно редуцирована по сравнению с ненарушенными участками болота. Молекулярный анализ состава метанотрофного сообщества с помощью ПЦР-ампли-фикации и клонирования фрагментов генартоА, кодирующего мембранную метанмонооксигеназу, выявил замену типичных ацидофильных болотных метанотрофов II типа менее активными в кислых средах метанотрофами I типа. Таким образом, как состав, так и активность метанокисляющего "фильтра" выгоревших участков верхового болота претерпели существенные изменения, четко прослеживаемые и после 7-летнего периода естественного восстановления экосистемы, что указывает на их долговременный характер.
Ключевые слова: северные болота, пожары на торфяниках, метанотрофные бактерии, окисление метана, ртоА гены.
DOI: 10.7868/S0026365615050043
Одной из важнейших биосферных функций болотных экосистем является регуляция круговорота парниковых газов СН4 и СО2 (Заварзин, Дедыш, 2008). Эта функция может быть существенно нарушена в результате пожаров (Zoltai et al., 1998; Wieder et al., 2009). Около 90% углерода сгоревшей биомассы растений и торфа высвобождается в виде СО2 (Levine et al., 1993), выброс которого в атмосферу из торфяников бореальной зоны во время пожаров оценивается в 8.4 Тг С год-1 (Gorham, 1991). Другими газообразными продуктами горения являются СО и СН4, потоки которых ориентировочно оцениваются в 1.0 и 0.1 Тг С год-1 (Zoltai et al., 1998). Однако помимо одномоментного выброса значительных количеств парниковых газов в атмосферу во время пожаров, не менее важны долговременные последствия нарушений сбалансированного протекания биогеохимических процессов в выгоревших торфяниках. Обогащение болотных вод зольными соединениями, возрастание величины рН, ускорение процессов минерализации органического вещества, изменение состава растительного сообщества могут оказывать существенное влияние на эмиссию парниковых газов
* Автор для корреспонденции (e-mail: dedysh@mail.ru).
(Zoltai et al., 1998). Так, есть сообщения о двукратном (Levine et al., 1990) и даже восьмикратном (Hogg et al., 1992) увеличении эмиссии СН4 из болотных экосистем, пострадавших от пожаров.
В наших предыдущих работах было показано, что на выгоревших участках мезотрофного торфяника наблюдаются значительные изменения в структуре и функциональной активности бактериальных сообществ, выражающиеся в ускорении процессов микробной деструкции органического вещества и увеличении численности сульфатредук-торов (Ахметьева и соавт., 2014; Belova et al., 2014). Типичные для нативного торфа, медленнорастущие бактерии групп Verrucomicrobia и Planctomycetes были вытеснены быстрорастущими колонизаторами из Proteobacteria, причем в числе последних была отмечена вспышка развития фитопатогена Agro-bacterium tumefaciens. В образцах торфа горелого локуса активности окисления СН4 были в 2 раза ниже, чем в торфе ненарушенного участка, то есть пожар привел к ослаблению естественного метанокисляющего "фильтра" мезотрофного торфяника (Belova et al., 2014). Последний, однако, характеризовался исходно низкими активностями метаногенеза, поэтому ослабление метанокисля-
ющего фильтра не повлекло за собой усиление эмиссии СН4.
Число работ, посвященных анализу изменений структуры и активности метанокисляющего микробного сообщества в результате пожаров, ограничено несколькими исследованиями. Объектом одного из них являлись кислые почвы хвойных бореальных лесов (Jaatinen et al., 2004), где было отмечено увеличение активности окисления метана без изменения состава метанокис-ляющих сообществ на выгоревших участках. В другой работе были исследованы кислые торфяники, покрытые Calluna vulgaris, на отдельных участках которых имело место периодическое выгорание растительного покрова (Chen et al., 2008). Достоверных различий в величине метанокисля-ющей активности торфа на выгоревших и неповрежденных участках торфяника выявлено не было, однако доля метанотрофов I типа в сообществах выгоревших локусов была значительно редуцирована. Таким образом, результаты этих исследований носят противоречивый характер. Для верховых болот аналогичных исследований ранее не проводилось. Настоящая работа была предпринята для восполнения этого пробела и ставила своей целью сравнительный анализ активности и состава микробного метанокисляю-щего сообщества на выгоревших и неповрежденных пожаром участках верхового болота Европейской части России.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования было верховое болото Тасин Борское (НП "Мещера", Владимирская область, 55°36' с.ш., 40°06' в.д), значительные территории которого были охвачены пожаром в 2007 году. Отбор образцов торфа для анализа проводили в июле 2014 года на не затронутом пожаром и выгоревшем участках болота, находящихся друг от друга на расстоянии 200 метров. Растительное сообщество неповрежденного участка болота представлено Sphagnum angustifolium, Sph. fuscum, Carex spp., Oxicoccus sp. и Andromeda polifolia. Выгоревший участок покрыт порослью Betula pubеscens и Salix cinerea; в травяном ярусе присутствуют Poly-trichum commune, Calamagrnstis epigеios, Agrostis gigantea, Rumex acetosella. Торф отбирали с глубины 0—10 см. Отобранные образцы транспортировали в лабораторию в пакетах с охлаждением и немедленно использовали для определения метанокис-ляющей активности торфа, определения численности метанотрофов и выделения ДНК для молекулярных исследований.
Определение химического состава болотной воды производили по аттестованным методикам в гидрохимической лаборатории Иваньковской НИС (Институт водных проблем РАН), Тверская обл., г. Конаково.
Определение скорости окисления метана образцами торфа. Навески по 10 г сырого торфа измельчали до фрагментов размера 10—15 мм, помещали в стерильные стеклянные флаконы объемом 160 мл, герметично закрывали флаконы и вводили метан до концентрации около 1000 ppm. Флаконы инкубировали при комнатной температуре. В периодически отбираемых из газовой фазы флаконов пробах (0.5 мл) определяли концентрацию метана на хроматографе Кристалл 5000 ("ЗАО Хроматек", Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Измерения проводили до полного исчезновения метана во флаконах. На основании полученных данных рассчитывали скорость окисления метана исследуемыми образцами торфа.
Оценку численности метанотрофных бактерий в образцах торфа проводили c использованием метода предельных разведений (метод MPN — Most Probable Number) на среде М2 (Danilova et al., 2013) с метаном в качестве источника углерода. Идентификацию клеток метанотрофов в вариантах с наибольшим разведением проводили с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). Для этого 0.5 мл клеточной суспензии накопительных культур фиксировали путем добавления 1.5 мл 4%-ого раствора формальдегида в фосфатном буфере (NaCl - 8.0 г, KCl - 0.2 г, Na2HPO4 - 1.44 г, NaH2PO4 - 0.2 г, H2O - 1 л, pH 7.0) в течение 1.5 часов. Затем клетки осаждали и промывали фосфатным буфером. Фиксированные образцы ресуспендировали в растворе 100% этанола и фосфатного буфера (1 : 1, об : об) и до анализа хранили при -20°С. 1-2 мкл суспензии фиксированных клеток наносили на стекла с окошками и проводили гибридизацию с зондами в соответствии со стандартной методикой (Stahl, Amann, 1991) при 46°С. Идентификацию клеток метанотрофов I типа осуществляли путем гибридизации с эквимолярной смесью СуЗ-меченых зондов М705 + М84, а метанотрофов II типа - с зондом М450 (Eller et al., 2001). Синтез зондов, меченных флуоресцентным красителем Cy3, осуществлялся компанией "Синтол" (Москва, Россия). Препараты анализировали с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Zeiss Ax-ioplan 2 (Йена, Германия) со светофильтрами Zeiss 20 для СуЗ-меченных зондов и Zeiss 02 для выявления автофлуоресценции клеток.
Оценка разнообразия метанотрофов в торфе путем ПЦР-анализа генов pmoA. Выделение тотальной ДНК из торфа производили с использованием набора "FastDNA SPIN kit for soil" (Biol 101, США) в соответствии с рекомендацией производителя. Полученную ДНК использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Оценку общего разнообразия метано-трофных бактерий в торфе проводили путем ПЦР-амплификации фрагментов гена pmoA, ко-
548
ДАНИЛОВА и др.
Химический состав (мг/л) вод верхового болота Тасин Борское после пожара 2007 года
№ Характеристика Ненарушенный Выгоревший
участок участок
1 рН 3.7 4.2
2 Минерализация 50 80
(^S/см-1)
3 С орг. 49.9 130.5
4 НСО3- 0 6.1
5 NO3- 0.9 6.9
6 NO2- 0.2 0.2
7 NH+ 3.0 3.9
8 SO4- 13.7 15.1
9 po4- 0.1 0.1
10 Ca2+ 4.9 8.9
11 Fe общ. 0.8 0.5
дирующего полипептид, несущии активный центр мембраной метанмонооксигеназы (мММО), для чего использовали праймеры A189f (Holmes et al., 1995) и mb661r (Costello, Lidstrom, 1999). ПЦР проводили на термоциклере PE GeneAmp PCR System 9700 ("Perkin-Elmer Applied Biosystems", США). Проверку продуктов ПЦР осуществляли путем их электрофореза в 1.2% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этиди-ем и визуализацией продуктов реакции с помощью УФ-трансиллюминатора. Полученные ам-пликоны были клонированы с помощью набора
CH4, ppm 1200,
1000 -
800 -
600
20
40
60
80
100 120 Часы
Рис. 1. Динамика концентрации метана в экспериментальных флаконах с торфом ненарушенного (1) и выгоревшего (2) участков болота Тасин Борское.
"pGem-T Easy Vector System II" (Promega
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.