ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2012, том 446, № 5, с. 590-593
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.816:591:577.175.822
СНИЖЕНИЕ ВХОДА КАЛЬЦИЯ В МОТОРНОЕ НЕРВНОЕ ОКОНЧАНИЕ ПРИ АКТИВАЦИИ ПРЕСИНАПТИЧЕСКИХ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ
© 2012 г. Э. Ф. Хазиев, Н. Ф. Фатихов, Д. В. Самигуллин, Г. Л. Барретт, Э. А. Бухараева, академик Е. Е. Никольский
Поступило 23.05.2012 г.
Ацетилхолин, поступивший в синаптическую щель из холинергических нервных окончаний после их деполяризации потенциалом действия, вызывает не только генерацию постсинаптического потенциала, но и модулирует интенсивность процесса выделения последующих порций медиатора, активируя пресинаптические ауторецепторы [1]. Эффекты эндогенного ацетилхолина воспроизводятся в экспериментах при добавлении в омывающий изолированный нервно-мышечный препарат экзогенного ацетилхолина или его аналогов, включая негидролизуемый холиномиме-тик карбахолин [2, 3]. В экспериментах на нервно-мышечном препарате лягушки показано, что добавление в перфузат карбахолина приводит к снижению интенсивности вызванной секреции квантов, о чем свидетельствуют снижение числа квантов (квантового состава), выделяемых в ответ на каждый нервный стимул, и изменение кинетики освобождения отдельных квантов, формирующих многоквантовый постсинаптический ответ. Эффект карбахолина на квантовый состав потенциалов концевой пластинки снижался в присутствии блокатора никотиновых рецепторов ё-ту-бокурарина [2, 3]. Поскольку процессы, ответственные как за величину квантового состава потенциалов концевой пластинки, так и за кинетику выделения квантов, являются кальцийзави-симыми (увеличение концентрации кальция в нервном окончании увеличивает квантовый состав и синхронизирует выделение квантов) [4, 5], естественно предположить, что в основе угнетающего эффекта холиномиметиков лежит уменьшение входа кальция в двигательное нервное окончание. Для проверки справедливости этой гипотезы в данном исследовании на изолированном
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской Академии наук Университет Мельбурна, Австралия Казанский государственный медицинский университет
нервно-мышечном препарате m.cutaneus pectoris и m. sartorius озерной лягушки Rana ridibunda сопоставляли изменение квантового состава токов концевой пластинки и входа кальция (Са2+-тран-зиент) в нервное окончание в ответ на одиночный стимул.
Нервно-мышечный препарат непрерывно пер-фузировали физиологическим раствором Рингера следующего состава (ммоль/л): NaCl 113.0, KCl 2.5, CaCl2 0.9, NaHCO3 3.0, MgCl2 5.0, pH раствора 7.2—7.4, температуру поддерживали на уровне 20.0 ± 0.3°С. Пониженное содержание ионов кальция в среде и присутствие магния предотвращало мышечные сокращения в ответ на стимуляцию нерва. Нерв раздражали с помощью всасывающего электрода прямоугольными импульсами длительностью 0.2 мс сверхпороговой амплитуды с частотой 0.5 имп/с. Регистрацию миниатюрных и вызванных токов концевой пластинки (мТКП и ТКП соответственно) осуществляли методом двухэлектродной фиксации потенциала на уровне —60 мВ, используя усилитель Axoclamp 900А и внутриклеточные электроды, заполненные раствором 3 M KCl с сопротивлением 5—10 мОм. Сигналы оцифровывали с помощью АЦП L-card и обрабатывали с помощью созданной в лаборатории программы. Средний квантовый состав ТКП оценивали методом деления площадей ТКП и мТКП.
Вследствие морфологических особенностей двигательного нервного окончания лягушки (малые размеры), не позволяющих прямым электрофизиологическим методом измерить входящий кальциевый ток, для анализа входа кальция был использован метод оценки флуоресцентного кальциевого транзиента, позволяющий оценить изменение внутриклеточной концентрации кальция как при ритмической активности синапса, так и в ответ на одиночный нервный импульс [6].
Оценку входа кальция в нервное окончание осуществляли с помощью измерения интенсивности свечения кальцийчувствительного флуо-
Рис. 1. Вызванные токи концевой пластинки и кальциевый транзиент в присутствии карбахолина и других холинер-гических агентов. а — ТКП в контроле и после действия 10 мкмоль/л карбахолина. Среднее из 60 сигналов. б — кальциевый транзиент в контроле и при добавлении в раствор 10 мкмоль/л карбахолина. Среднее из 60 сигналов. в — изменение амплитуды Са2+-транзиента в присутствии 10 мкмоль/л карбахолина и других холинергических агентов (мкмоль/л): никотина — 10; мускарина — 10, ё-тубокурарина — 10; атропина — 1. Звездочкой отмечены значения, достоверно (р < 0.05) отличающиеся от амплитуды Са2+-транзиента в контроле, принятой за единицу.
ресцентного красителя (Са2+-транзиент), взаимодействующего с кальцием, входящим в нервное окончание после развития пресинаптического потенциала действия [7]. Загрузку флуоресцентного красителя Oregon green Bapta 1 выполняли через культю нерва. Регистрацию Са2+-транзиен-та осуществляли c помощью фотометрической установки на базе микроскопа Olympus BX-51 с водноиммерсионным объективом х60 и высокочувствительным регистратором на основе фотодиода S1087 ("Hamamatsu") [6]. Для выбора области регистрации Са2+-транзиента использовали оптическую систему Viewfinder ("Till Photonics"). Свет с длиной волны, необходимой для возбуждения красителя (488 нм), генерировали с помощью монохроматора Polychrom V ("Till Photonics"). Сигнал с фотодиода оцифровывали с помощью
АЦП Digidata 1200B ("Axon Instruments"). Запись Са2+-сигналов, синхронизацию освещения и стимуляцию проводили при помощи программы WinWcp Stanford University. Изменение флуорес-
Д F
ценции представляли как — — относительное
Fo
изменение интенсивности флуоресценции по отношению к фоновому свечению. В каждом эксперименте проводили усреднение 60 флуоресцентных ответов в контроле и после 20 мин действия исследуемых веществ.
Эксперименты показали, что добавление карбахолина в концентрации 10 мкмоль/л приводило к снижению амплитуды мТКП и ТКП на 26 ± 5% (n = 4, P < 0.05) и 61 ± 8% (n = 4, P < 0.05) соответственно (рис. 1а). Расчет среднего квантового со-
592
ХАЗИЕВ и др.
става методом деления площадей показал, что в присутствии карбахолина квантовый состав уменьшался на 46 ± 10% (п = 4, Р < 0.05) по сравнению с контролем.
Для того чтобы оценить, связано ли снижение квантового состава под действием карбахолина с уменьшением входа ионов кальция в нервное окончание, оценивали величину кальциевого транзиента. Стимуляция двигательного нерва одиночным стимулом вызывала флуоресцентный ответ (рис. 1б), обусловленный входом ионов Са2+ в нервное окончание и их взаимодействием с красителем [7]. Добавление в перфузионный раствор карбахолина в концентрации 10 мкмоль/л приводило к достоверному снижению амплитуды Са2+-транзиента на 11 ± 1% (п = 5, Р < 0.05) по сравнению с контролем (рис. 1б). Таким образом флуоресцентный анализ показал, что в основе пресинаптического действия карбахолина на процесс выделения медиатора действительно лежит уменьшение входа кальция в нервное окончание.
Поскольку карбахолин, так же как и ацетилхо-лин, активирует как никотиновые, так и муска-риновые рецепторы, то для выяснения типа рецепторов, опосредующих его угнетающее пре-синаптическое действие, исследовали влияние специфических никотиновых и мускариновых агонистов на величину Са2+-транзиента. Никотин в концентрации 10 мкмоль/л достоверно снижал амплитуду Са2+-транзиента на 15 ± 3% (п = 6, Р < 0.05) по сравнению с контролем. При действии мускарина (10 мкмоль/л) также наблюдалось уменьшение Са2+-транзиента на 8 ± 2% (п = 5, Р < 0.05), рис. 1в.
Предварительная блокада никотиновых рецепторов ё-тубокурарином (10 мкмоль/л) вызывала достоверное уменьшение действия никотина на амплитуду Са2+-транзиента. Обработка нервно-мышечного препарата блокатором мускари-новых рецепторов — атропином (1 мкмоль/л) — полностью устраняла эффект мускарина на Са2+ транзиент (рис. 1в). Таким образом, описанное нами действие карбахолина, угнетающее вызванную секрецию квантов медиатора, обусловлено снижением входа ионов Са2+ в нервное окончание вследствие активации никотиновых и мускариновых пресинаптических холиноре-цепторов.
Обращает на себя внимание тот факт, что относительно небольшое изменение входа кальция в терминаль вызывает существенное угнетение вызванного освобождения медиатора. Это можно объяснить, принимая во внимание, что зависимость величины квантового состава от содержания кальция является экспоненциальной [4]. По-
лученные нами данные о влиянии мускарина на вход кальция в нервное окончание не согласуются с результатами I. Slutsky и др., которые не обнаружили под действием мускарина изменение Са2+-тока, хотя и наблюдали снижение квантового состава постсинаптического ответа [8, 9]. Измерения Са2+-тока эти авторы осуществляли в условиях фокальной стимуляции нерва в присутствии высоких концентраций блокаторов натриевой и калиевой проводимости нервного окончания, которые могли модифицировать работу пресинаптических кальциевых каналов. Механизм уменьшения входа Са2+ в нервное окончание при активации холинорецепторов пока неясен. Можно предположить несколько путей изменения входа ионов кальция в нервное окончание под действием холинергических соединений. Это может быть прямое воздействие на проводимость потенциалзависимых кальциевых каналов N-типа, как полагали Van der Kloot и др., наблюдая снижение квантового состава потенциалов концевой пластинки в синапсах лягушки под действием карбахолина, выраженность которого уменьшалась в присутствии оме-га-конотоксина, блокирующего каналы данного типа [10]. Другим механизмом может быть быстрая активация кальций-секвестрирующих систем в нервном окончании, которая происходит вследствие увеличения входа кальция через ионные каналы, открываемые при активации никотиновых холинорецепторов [11]. Кроме того известно, что рецепторы мускаринового типа непосредственно сопряжены с потенциалзависимыми Са2+-кана-лами N- и P/Q-типов через G-белки и таким образом ингибируют кальциевый ток и обеспечивают отрицательную обратную связь, как это наблюдается для большинства нейромедиаторов в синапсах центральной нервной системы, включая ацетилхолин,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.