СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2008, том 22, № 3, с. 248-256
= НОЦИЦЕПЦИЯ
УДК 612.822.3
СНИЖЕНИЕ ВОЗБУДИМОСТИ НОЦИЦЕПТОРОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ГАММА-ПИРИДОНОВ
© 2008 г. Т. Н. Шелых1, И. В. Рогачевский, В. Б. Плахова, И. Н. Домнин2,
С. А. Подзорова, Б. В. Крылов
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 199034 Санкт-Петербург, наб. Макарова, д. 6
E-mail: krylov@infran.ru 1 Институт цитологии РАН, 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4 2 Санкт-Петербургский государственный университет, химический факультет, 198904 Старый Петергоф, Университетский пр., 26 Поступила в редакцию 18.12.2007 г.
Методом локальной фиксации потенциала исследовано действие двух представителей ряда у-пири-донов: 5-гидрокси-2-гидроксиметил-у-пиридона (АК1) и 5-гидрокси-1-метил-у-пиридон-2-карбоно-вой кислоты (АК2) на мембрану ноцицептивных нейронов дорзальных ганглиев крыс. Оно приводило к снижению эффективного заряда активационной воротной системы медленных (тетродоток-синнечувствительных, Nav 1.8) натриевых каналов, причем наблюдаемый эффект устранялся при предварительном добавлении в наружный раствор неспецифического блокатора опиодных рецепторов налоксона. При помощи неэмпирических квантовохимических расчетов ограниченным методом Хартри-Фока с применением базиса 6-31G* по программе GAMESS была осуществлена полная оптимизация геометрических параметров молекул АК1 и АК2 в формах свободных кислот, их анионов, кальциевых солей, хелатных комплексов с Ca2+ и кальциевых солей хелатных комплексов. Полученные результаты позволили предположить, что молекулы АК1 и АК2 связываются с не-идентифицированным опиоидоподобным мембранным рецептором в форме кальциевой соли хе-латного комплекса с Ca2+, при этом основной вклад в энергетику лиганд-рецепторного взаимодействия вносит образование ион-ионных связей между Ca2+ и отрицательно заряженными функциональными группами в составе рецептора.
Ключевые слова: у-пиридоны, тетродотоксиннечувствительные (TTXr) натриевые каналы, опиои-доподобные рецепторы, ноцицепторы, квантовохимические расчеты.
ВВЕДЕНИЕ
Многие представители структурно-химического класса у-пиридонов (4(1Н)-пиридинонов) обладают важными фармакологическими свойствами (Aytemir et al., 1999; Erol, Yulug, 1994; Dexter et al., 1989). Известно, что некоторые производные у-пиридонов способны оказывать антигипертен-зивное (Ozturk et al., 2002), противоопухолевое Ozturk et al., 2002; Hwang et al., 1980; Timeus et al., 1994; Enna, Maggic, 1979), противовоспалительное (Aytemir et al., 1999), антибактериальное (Erol, Yulug, 1994; Feng et al., 1993), противогрибковое (Ozturk et al., 2002), антималярийное (Hershko et al., 1991; Sakagami et al., 1990) действие, могут влиять на сердечно-сосудистую систему (Williams, 1976) и используются при лечении болезни Паркинсона (Dexter et al., 1989). Они также представляют интерес в качестве субстанций лекарственных препаратов, улучшающих баланс ионов при нарушениях метаболизма металлов, например, для лечения анемии, талассемии, гемохроматоза (Thompson et al., 2006). Кроме того, некоторые представители
этого ряда соединений обладают анальгетиче-ской активностью (Ozturk et al., 2001; Ozturk et al., 2002; Armit, Nolan, 1931).
В соответствии с современными взглядами кодирование болевого сигнала ноцицепторами в ряде случаев определяется функционированием медленных тетродотоксиннечувствительных (TTXr) натриевых каналов. Регистрация электрической активности мембраны нейрона позволяет количественно оценить взаимодействие между медленными натриевыми каналами и связанными с ними мембранными рецепторами. В случае, когда исследуемая субстанция снижает потенциалочув-ствительность медленных натриевых каналов путем взаимодействия с мембранным рецептором, связанным с указанным типом каналов, происходит модуляция импульсного потока с выключением лишь его ноцицептивной компоненты. При этом сам канал связи остается нормально функционирующим и способным передавать сигналы других модальностей. В этом принципиальное отличие разрабатываемого нами подхода от, напри-
мер, хорошо известного механизма полной блокады проводящих путей при действии местных анестетиков.
Современная клиническая практика показывает, что выбор анальгетических препаратов, не имеющих негативных побочных эффектов, весьма ограничен. Благодаря своим свойствам у-пири-доны и у-пироны, имеющие в отличие от у-пири-донов атом кислорода в качестве гетероатома шестичленного цикла, представляют интерес как перспективный материал для создания анальгетиков нового поколения, мембранной мишенью действия которых могут служить опиодоподоб-ные рецепторы (Крылов и др., 1999).
Ранее на основании результатов квантовохи-мических расчетов равновесной геометрии и электронного строения производных у-пирона в различных молекулярных формах было получено представление о возможности их взаимодействия с неорганическими катионами, и предложен механизм лиганд-рецепторного связывания с обнаруженными нами опиоидоподобными рецепторами (Рогачевский, Плахова, 2006). Весьма вероятно, что это связывание осуществляется в форме кальциевой соли хелатного комплекса с Ca2+. В процессе солеобразования задействована карбоксильная группа у-пирона в а-положении к атому кислорода шестичленного цикла, в то время как в хелати-ровании Ca2+ принимают участие карбонильная и гидроксильная (или метокси-) группы, находящиеся в соседних положениях пиронового кольца. При этом предполагается, что основной вклад в энергетику лиганд-рецепторного взаимодействия вносит образование солевых связей между Ca2+ и отрицательно заряженными функциональными группами в составе опиоидоподобного рецептора (Рогачевский, Плахова, 2006). Исследуемые нами в настоящей работе производные у-пиридонов, вероятно, связываются с неидентифицированным опиоидоподобным мембранным рецептором аналогичным образом. Они также проявляют свою физиологическую активность в форме кальциевой соли хелатного комплекса с Ca2+, при этом основной вклад в энергетику лиганд-рецепторного взаимодействия вносит образование ион-ионных связей между Ca2+ и отрицательно заряженными функциональными группами в составе рецептора.
Именно эта задача решается в настоящей работе с помощью метода локальной фиксации потенциала (patch-clamp method) в конфигурации регистрации активности целой клетки ("whole-cell") и квантовохимических расчетов. Нами проведено исследование влияния двух представителей ряда у-пиридонов: 5-гидрокси-2-гидроксиметил-у-пири-дона (АК1) и 5-гидрокси-1-метил-у-пиридон-2-карбоновой кислоты (АК2) на медленные ТТХГ натриевые каналы сенсорных нейронов крысы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты были выполнены на культивируемых изолированных нейронах спинальных ганглиев новорожденных крысят линии Wistar. Для выделения ноцицептивных (темных, небольшого диаметра, характеризуемых высокой плотностью медленных натриевых каналов) нейронов применяли модифицированный метод краткосрочного культивирования (Elliott, Elliott, 1993), обеспечивающий высокий выход жизнеспособных клеток. Использованная методика выделения подробно описана нами ранее (Плахова и др., 2000).
В экспериментах использовали следующие стандартные растворы (концентрации представлены в ммоль/л). Внеклеточный раствор: NaCl - 65, CaCl2 - 2, MgCl2 - 2, Choline Cl - 70, HEPES-Na - 10, TTX (тетродотоксин) - 0.0001, pH 7.4. Внутриклеточный раствор: CsF - 100, NaCl - 10, CsCl - 40, MgCl2 - 2, HEPES-Na - 10, pH 7.2. Исключение ионов калия позволило избавиться от всех компонентов калиевого тока, а ионы фтора во внутриклеточном растворе обеспечивали блокирование кальциевых токов (Elliott, Elliott, 1993; Kostyuk et al., 1975). Наличие во внеклеточном растворе тет-родотоксина блокировало функционирование быстрых тетродотоксинчувствительных каналов, что делало возможным исследовать ответы только медленных ТТХГ натриевых каналов. Все опыты проводили при комнатной температуре 22-24°С.
В работе использовались реактивы фирмы "Sigma", за исключением агентов АК1 и АК2, синтезированных по методам (предложенным другими авторами) (Heyns, Vogelsang, 1954; Mo-lenda et al., 1994). Субстанции АК1 и АК2 в концентрации 1 мкмоль/л, а также неспецифический блокатор опиоидных рецепторов налоксон в концентрации 50 мкмоль/л, добавляли в наружный раствор. Эксперименты проводили с использованием аппаратно-программного комплекса на основе усилителя "L/M EPC-7", ПЭВМ и системы автоматизации, разработанной ранее (Крылов и др., 1999).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование ответов ноцицептивных нейронов методом локальной фиксации потенциала. Первым этапом проведения экспериментов являлась регистрация семейств натриевых токов в соответствии с программой эксперимента в контрольных условиях и после воздействия исследуемых агентов (рис. 1). Действие АК1 в концентрации 1 мкмоль/л (рис. 1, б) и АК2 в такой же концентрации (рис. 1, г), приложенных с наружной стороны мембраны, приводило к изменению
Рис. 1. Семейства медленных натриевых токов до и после приложения АК1 и АК2.
а - контрольные записи; • - семейство натриевых токов после приложения 1 мкмоль/л АК1. Тестирующий потенциал изменялся от -50 до 40 мВ с шагом 10 мВ; в - контрольные записи; „ - семейство натриевых токов после приложения 1 мкмоль/л АК2. Тестирующий потенциал изменялся от -45 до 45 мВ с шагом 10 мВ.
Во всех записях поддерживаемый потенциал, длительность которого составляла 500 мс, был равен - 110 мВ. Токи утечки и емкостные токи вычтены программным способом.
ряда характеристик медленных натриевых каналов. Сравнение семейств натриевых токов, зарегистрированных до и после действия указанных соединений, позволяет заключить, что амплитуда тока уменьшается (рис. 1, а-г). Это уменьшение амплитуды, главным образом, обусловлено так называемым "run-down эффектом", являющимся ограничением, внутренне присущим методу локальной фиксации потенциала. Поэтому наиболее важным стационарным параметром, определяющим процесс первичного кодирования ноци-цептивной информации, служит эффективный заряд (Zeff) активационной воротной системы медленных натриевых каналов (TTXr или Nav 1.8). Именно этот п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.