БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 5, с. 975-980
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 576.5:577.3:591.3
СОБСТВЕННАЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ НЕОБЛАСТОВ ПЛАНАР ИИ В П P ОЦЕССЕ P ЕГЕНЕРАЦИИ
© 2015 г. Х.П. Тирас* **, С.В. Гудков* ** *** ****, В.И. Емельяненко* *****, К.Б. Асланиди*
*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области, Институтская ул., 3;
**Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290, Пущино Московской области, пр. Науки, 3;
***Институт общей физики им. А .М . Прохорова РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 38; ****Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского,
603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23; *****Институт биологического приборостроения РАН, 142290, Пущино Московской области, Институтская ул., 7 E-mail: kbaslanidi@gmail.сот Поступила в p едакцию 06.08.15 г.
Исследованы кинетики люминесценции, индуцированной активными формами кислорода у планарий в процессе регенерации. Установлено, что регенерация сопровождается изменениями концентрации активных форм кислорода, коррелирующими с энергозатратными процессами, такими как окислительный стресс, вызванный повреждениями клеточных мембран при рассечении планарии, фагоцитоз погибающих клеток и митоз необластов. Впервые показана возможность регистрации физиологического состояния плюрипотентных стволовых клеток на уровне организма in vivo.
Ключевые слова: активные формы кислорода, хемилюминесценция, планария, регенерация, необласт, апоптоз, фагоцитоз, митоз.
По данным PubMed количество публикаций по ключевым словам «reactive oxygen species» за последние 20 лет выросло более чем в четыре раза и превысило 158000. Активные фор мы кислорода (АФК) в клетках образуются в про -цессе нормального аэробного клеточного метаболизма и в результате воздействий на организм факторов окружающей ср еды, таких как ионизирующие и УФ -излучения, ксенобиотики и др [1-3]. АФК игр ают двоякую роль в клетках, тканях и органах. C одной стороны, АФК уча -ствуют во многих патологических процессах, таких как нейродегенеративные изменения, кар-диоваскулярные нарушения и онкологические заболевания. C другой стор оны, АФК необхо -димы для нормальной жизнедеятельности, в частности, АФК принимают непосредственное участие в процессах регенерации. При этом определенные клетки дифференцируются или дедифференцируются, либо вступают в мито-тический цикл, либо входят в апоптоз и само-
Сокращение: АФК - активные формы кислорода.
устраняются [4]. Показано, что механизмы регенерации у различных животных, от дрозофилы до гидры, планарий, данио рерио и даже мышей, имеют много общего. У всех пер ечис-ленных животных механическая травма сопро -вождается некрозом и/или апоптозом поврежденных клеток, фагоцитозом, пролиферацией, первичной специализацией и/или миграцией плюрипотентных стволовых клеток. Поврежденные клетки высвобождают АФК, которые вызывают у эффекторных клеток активацию МАРК- и/или ЖК-путей внутриклеточной сигнализации [5]. Классической моделью для изучения процесса регенерации и биологии стволовых клеток признаны пресноводные плана-рии [6,7]. При этом роль АФК в жизнедеятельности планарий изучена очень фрагментарно. Целью работы было исследование кинетики АФК-индуцированной люминесценции у пла-нар ий в пр оцессе р егенерации. Установлено, что регенерация сопровождается изменениями концентрации АФК, коррелирующими с энергозатратными процессами, такими как окислительный стресс, вызванный повреждениями кле-
28
О 5 10 15
Время, ч
P ис. 1. Кинетики хемилюминесценции. По вер тикали - интенсивность хемилюминесценции I, имп/с, по горизонтали - время, ч. 1 - Интенсивность хемилюминесценции, зар егистр ир ованная от 10 мл чистой воды, 2 - интенсивность хемилюминесценции, зар егистр ир ованная от 30 интактных плана-рий, помещенных в 10 мл чистой воды, 3 - интенсивность хемилюминесценции, зар еги стр ир ованная от тех же 30 планарий, помещенных в 10 мл чистой воды сразу после декапитации.
точных мембр ан пр и ра ссечении планар ии, фа -гоцитоз погибающих клеток и митоз необлас-тов. Более того, полученные данные позволяют предположить, что митоз у двух популяций необластов р азделен по вр емени.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ И ССЛЕДОВАНИЯ
В экспер иментах пр именяла сь бесполая ра са пр есноводных чер вей - планар ий Dugesia (Gi-rardia) tigrina. Планар ий содер жали в аквар и-умной воде пр и жесткости около 3-5 мг-экв/литр, рН 6,5 и темпер атур е 26°С. Кор мили личинками двукр ылых. Для экспер иментов отбирали животных длиной около 10-11 мм после недельного голодания. Регенерацию вызывали ампутацией головной ча сти планар ии на ур овне «глаз» [8]. В каждой сер ии экспер иментов интактных планар ий или их фр агменты помещали в 10 мл воды внутр и специальных полипр опи-леновых сцинтилляционных кювет (Вескшаи, USA). Для измер ения люминесценции использовали хемилюминометр Биотокс-7А 2М (АН О «Инженер ный центр - экология», Р о ссия). П р и-бор о снащен фотоумножителем 9750QB/1 (9750QB/1, EMI E^tron^s LTD, Middlesex UK), область спектральной чувствительности со ставляет 380-710 нм. Измер ения пр оводили пр и темпер атур е 26,0 ± 0,2°С, в р ежиме счета фотонов с интервалом записи данных 1 с. Полученные зависимости сглаживали с использованием программного продукта SigmaPlot 8.0
c помощью функции smooth 2D Data. Частота сеплир ования сигналов после сглаживания пр е-вышала 5 мин. Для анализа люминесцентного сигнала, вызванного травмированием плана-р ии, использовали р азность кинетик люминесценции интактных планар ий и тех же о собей после рассечения. Полученную разностную кр и -вую анализир овали используя пр огр амму, о снованную на методе Маркуардта [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Р егистр ир овали зависимо сть хемилюминесценции 10 мл чистой воды, 30 о собей интактных планар ий, помещенных в 10 мл чистой воды, и тех же 30 о собей после декапитации, помещенных в 10 мл чистой воды (р ис. 1). Вр емя непр ерывной р егистр ации люминесценции со -ставляло 15 ч.
Анализ полученных зависимостей позволяет заключить, что уровень хемилюминесценции воды, р егистр ируемый системой, со ставляет в среднем 10-11 импульсов в секунду. На этом фоне все регистр ируемые кинетики демонстр и -р уют затухание хемилюминесценции в течение вр емени р еги ст р ации:
1. Изменения хемилюминесценции чистой воды незначительно изменяется во вр емени.
2. Сигнал хемилюминесценции, регистри-р уемый от 30 интактных планар ий, помещенных в 10 мл чистой воды, почти в два раза превысил сигнал, регистрируемый от чистой воды, и за 15 ч уменьшился почти на 20%.
3. Сигнал хемилюминесценции, регистри-р уемый от 30 декапитир ованных планар ий, помещенных в 10 мл чистой воды, примерно в два р аза пр евы сил сигнал, р егистр ируемый от чистой воды, а за 15 ч уменьшился более чем на 40%.
Полученные результаты позволяют выявить р азличные источники хемилюминесценции.
Кривая 1 на рис. 1 описывает хемилюми-несценцию воды и пр исутствует во всех полученных кинетиках. Известно, что источником свободных радикалов в чистой воде являются молекулы р аствор енного кислор ода. В чистой воде, насыщенной атмосферным воздухом, при используемой в экспер именте темпер атур е 26°С пр оисходит регистр ир уемое обр азование активных фо р м кислор ода [10,11].
К р ивая 2 на р ис. 1 описывает хемилюми -несценцию воды и хемилюминесценцию интактных планар ий, а разность кинетик 1 и 2 опр е-деляет изменения хемилюминесценции интактных планар ий. Известно, что главным источником всех радикалов в нормально функцио-
С ОБ С ТВЕННАЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ НЕОБЛАС ТОВ ПЛАНАРИИ 977
нирующих клетках служит реакция одноэлек-тр онного во сстановления молекуляр ного кисло-р ода, пр иводящая к обр азованию супер оксида-нион-р адикала. С упер оксиданион-р адикал обр азуется НАДФН-оксидантным комплексом клеточных мембран: цитоплазматической мем-б р аны, мембр аны эндоплазматического ретику-лума и внутр енней мембр аны митохондрий [4,12]. Во всех случаях активация НАДФН-ок-сидантного комплекса связана с функциональной нагр узкой и деполяр изацией соответствующих мембр ан, что особенно сильно пр оявляется пр и развитии окислительного стр есса. Вто р ым источником свободных радикалов в живых клетках является монооксид азота N0, образуемый разными N0-cинтетазами. В норме в организме по разным оценкам от 2 до 30% потребляемого кислорода преобразуется в АФК. Повышение функциональной нагр узки, в частности двигательной активности, приводит к резкому ро сту пр оизводства АФК. Отметим, что на яр ком свету пр и отбор е и помещении в сцинтилляционную кювету планар ии активно двигались, что приводило к увеличению количества АФК, а после помещения в темноту измерительной камеры люминометра - успокаивались и р егистр ируемый ур овень хемилю -минесценции медленно падал.
Кривая 3 на рис. 1 описывает хемилюми-несценцию воды и хемилюминесценцию дека -питир ованных планар ий, а разность кинетик 3 и 2 определяет изменения хемилюминесценции, вызванные тр авмой. У декапитир ованных планар ий, по ср авнению с интактными, количество источников свободных радикалов резко возрастало. Нар ушение плазматических мембр ан пр и-водило к развитию окислительного стр есса, ко-тор ый обычно пр оявляется в накоплении пр о -дуктов окисления липидов, белков и поврежденных о снований ДНК, а также в снижении ур овня антиоксидантов и повышенной воспр и-имчивостью липидов мембр ан и липопр отеинов к действию пр ооксидантов, включая ионы Бе2+ или Н202 [4,12]. К р оме того, хемолюминесцен-ция могла возникать при взаимодействии белка или отдельных аминокислот с пер оксинитр итом (N0). Установившееся значение хемилюминесценции у тр авмир ованных планар ий также существенно пр ево сходило соответствующие зна -чения у интактных животных и чистой воды. Это означает, что тр авма активирует механизмы регенер ации, длительно сть котор ы х пр евы -шает длительно сть «успокоения» после нормальной двигательной активности, регистри-р уемой у интактных планар ий после помещения в сцинтилляционную кювету.
Время, ч
Р ис. 2. Разность кинетик
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.