ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 1, с. 71-75
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.51:543.612.3
СОЧЕТАНИЕ СВЕРХКРИТИЧЕСКОЙ ФЛЮИДНОЙ ЭКСТРАКЦИИ И ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. АНАЛИЗ ВОЛОС. ОБРАБОТКА ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ ДАННЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАТЕМАТИЧЕСКОГО АЛГОРИТМА CODA
© 2007 г. А. В. Богданов, И. Н. Глазков, И. А. Ревельский
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет
119992 Москва, ГСП-3, Ленинские горы Поступила в редакцию 12.10.2005 г., после доработки 29.11.2005 г.
Определен состав среднелетучих органических соединений, извлеченных при использовании сверхкритической флюидной экстракции (СФЭ) из волос человека с улавливанием всего экстракта из газового потока на выходе из экстрактора в сорбционное устройство, термодесорбцией в хромато-масс-спектрометр (ГХ-МС) и идентификацией экстрагированных соединений как с помощью прямой обработки хромато-масс-спектрометрических данных, так и с использованием математического алгоритма CODA. Сочетание СФЭ без использования органических растворителей с переводом всего экстракта в хромато-масс-спектрометр при прямом анализе хромато-масс-спектрометриче-ских данных позволило определять органические соединения на уровне 3.9 пг/мг волос. Математический алгоритм обработки хромато-масс-спектрометрических данных CODA позволил определять соединения на уровне 1.7 пг/мг волос, что в подавляющем большинстве работ достигается либо селективным ионным детектированием либо методом ГХ-МС-МС.
Исследования в области неорганического анализа волос показали, что минеральный состав волоса отражает минеральный состав организма в целом и его взаимосвязь с внутренними и внешними воздействиями на человека. Это относится и к органическому составу, но этот аспект менее изучен.
В настоящее время среднелетучие органические соединения определяют в волосах преимущественно в судебно-медицинской экспертизе и токсикологии [1-3]. Менее изучена диагностика различных заболеваний по анализу волос - например, найдено, что при раковых заболеваниях либо при болезни Альцгеймера в волосах увеличивается содержание полиаминов [4]. Актуальной задачей является поиск среднелетучих соединений -загрязнителей внутренней среды организма. Кроме того, представляет интерес обнаружение соединений, присутствие которых является признаком различных заболеваний.
Обнаружение таких соединений осложняется наличием в волосах огромного числа органических соединений, на фоне которых требуется определить вещества-маркеры конкретных заболеваний. Методы выделения органических соединений, разработанные для нужд криминалистики, здесь не подходят. Большинство методик включает кислотную либо щелочную обработку волос, при этом многие соединения могут оказаться неустойчивыми, как например, соединения класса бензодиазепинов, которые деструктурируются,
образуя множество продуктов, включая бензофе-ноны [3].
Актуален поиск способов извлечения, с высокой степенью и без разложения, среднелетучих органических соединений.
Сверхкритическую флюидную экстракцию (СФЭ) применяют при анализе волос с середины 90-х гг. в качестве альтернативы кислотным либо щелочным методам, при этом степени извлечения сравнимы, а зачастую и выше, чем в упомянутых выше методах. Существующие методики с использованием СФЭ предназначены для определения конкретных соединений, в подавляющем большинстве - наркотиков. После извлечения из волос сверхкритический флюид декомпрессируют в органический растворитель либо на сорбент, с которого затем соединения элюируют растворителем. Растворитель упаривают до объема 1-2 мл, при этом концентрируются микропримеси из растворителей (так как чистота органических растворителей не превышает 99.5%). В случае определения заранее заданных соединений этот факт можно проигнорировать, например, в ГХ-МС можно использовать режим селективного ионного детектирования, однако при определении в волосах неизвестных органических соединений примеси из растворителя могут быть восприняты как экстрагированные из волос и привести к ложным результатам. Анализу подлежит только 0.001-0.01 часть экстракта, что увеличивает предел обнаружения. Если большинство
наркотических соединений содержится в волосах на уровне 0.01-5 нг/мг, то неизвестные соединения могут находиться на более низком уровне концентраций, поэтому актуален анализ всего концентрата. Одним из возможных путей решения проблемы может быть сочетание СФЭ с улавливанием определяемых соединений на сорбент и термодесорбцией выделенных соединений с сорбента в ГХ-МС [5.6].
При анализе сложных смесей неизвестного состава особенно важен первый этап - обнаружение максимального числа компонентов смеси. При анализе волос эта задача осложнена наличием огромного числа соединений, которые отличаются по содержанию в волосах в сотни, и даже в тысячи раз, а также высоким уровнем фона. Для ускорения обработки хромато-масс-спектромет-рических данных, а также для уменьшения уровня фоновых пиков в масс-спектрах разработаны различные математические алгоритмы: CODA, Bill-er-Bieman, Amdis и др. [7-12]. Алгоритм CODA (COmponent Detection Algorithm) в рамках определения всех неизвестных соединений в волосах представляется предпочтительным ввиду уменьшения фона на хроматограмме по полному ионному току путем удаления фоновых пиков из масс-спектров. При этом автоматически сглаживаются масс-хроматограммы по всем массам по определенному числу сканов (число сканов задается параметром "ширина сглаживающего окна"); для каждой массы сравнивается исходная и сглаженная кривые. По степени их соответствия каждой масс-хроматограмме присваивается определенный индекс соответствия (Mass Chromato-gram Quality, MCQ) в диапазоне значений от 0 до 1. Масс-хроматограммы с индексом соответствия ниже заданного удаляются, и данные массы удаляются из каждого масс-спектра. Это снижает уровень фона, а следовательно, облегчает нахождение неизвестных соединений, присутствующих в волосах, которые при прямом анализе ввиду малых содержаний могут быть неотличимы от фона.
Целью данной работы явилось исследование состава среднелетучих органических соединений, извлеченных при использовании СФЭ из волос человека с улавливанием всего экстракта из газового потока на выходе из экстрактора в сорбци-онное устройство, термодесорбцией в ГХ-МС и идентификацией экстрагированных соединений как прямой обработкой хромато-масс-спектро-метрических данных, так и с использованием математического алгоритма CODA.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Для сверхкритической флюидной экстракции использовали систему Carlo Erba Instruments SFE 300 с ячейкой для СФЭ объемом 0.4 мл из нержавеющей стали. В качестве флюида использовали
N2O (медицинский). Для улавливания соединений из газового потока на выходе из флюидного экстрактора использовали сорбционное устройство собственного изготовления, заполненное сорбентами Тенакс и Хромосорб W с 15% SE-30. В качестве внутренних стандартов использовали 1,4-ди-хлорбензол^4, нафталин^8, аценафтен-dlO, фе-нантрен-dlO, хризен^12 и перилен^12 (Absolute Standards Inc., Хамден, США). Анализ экстракта проводили на хроматографе Varian 3400 с колонкой 30 м х 0.32 мм х 0.5 мкм с неподвижной фазой CPSil 24CB Lowbleed/MS, в сочетании с масс-спектрометром фирмы Finnigan модели INCOS 50. В качестве газа-носителя использовали гелий (1.5 мл/мин). Неизвестные соединения идентифицировали с использованием программного обеспечения Xcali-bur Home Page v. 1.1, ACD/Labs Mass Manager v. 8 и библиотеки масс-спектров NIST.
Измельченные волосы (50 мг) помещали в экстракционную ячейку объемом 0.4 мл и термоста-тировали при 80°C. Экстракцию проводили в динамическом режиме с использованием N2O под давлением 250 атм в течение 15 мин, улавливание осуществляли в сорбционную ловушку, подсоединенную к рестриктору СФЭ-системы. Термодесорбцию в хромато-масс-спектрометр проводили в течение 15 мин при 270°C при потоке газа-носителя через сорбционную ловушку 3 мл/мин. Температуру термостата изменяли по следующей программе: 40°C (15 мин) —► 10°/мин —► 270°C (40 мин). Температура соединительной линии 250°C; температура ионного источника 180°C; энергия электронов 70 эВ. Диапазон сканируемых масс 50-500 а.е.м. при скорости сканирования 2 скана в секунду.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Вначале определяли экстрагированные из волос соединения без использования математических алгоритмов обработки хромато-масс-спек-трометрических данных. На хроматограмме по полному ионному току находили пики с соотношением сигнал/шум >2 : 1, отсутствующие на хроматограмме контрольного опыта. Для получения характеристичного масс-спектра вблизи максимума каждого пика на полученной масс-хромато-грамме усредняли 3-5 сканов и вычитали фоновый спектр.
Далее каждый полученный масс-спектр дополнительно очищали от фоновых пиков. Пики высотой менее 1% (округленное значение - т.е. от 0.5%) удаляли из масс-спектра. После этого строили масс-хроматограммы по каждому оставшемуся пику в масс-спектре. При отсутствии пика на данной масс-хроматограмме при данном времени удерживания пик удаляли из масс-спектра.
Полученные таким образом масс-спектры далее использовали для поиска в библиотеке масс-
СОЧЕТАНИЕ СВЕРХКРИТИЧЕСКОИ ФЛЮИДНОИ ЭКСТРАКЦИИ
73
Интенсивность, % 149ч
100
80 60 40 20
281 . 375 г„н 355\ \ 42У75\
80 160 240 320 400 480
149\
57
223, 278
\ 267 \ 323 375 430 464
\ \ /
80
160 240 320 400 480
100 149^ 149^
80 - -
60 - 3 - 4
40 - -
20 56 /104ч и iL 223 х 278 » 376, f | |26\\ 35\\ 432\ 477х ~/56 104 1 9\\ 132 1 J Ц 2\ 223 205 278 ■ J 1 ■
80 160 240 320 400 480
m/z
100
150
m/z
200
250
Рис. 1. Масс-спектр пика со временем удерживания 20.35 мин на разных стадиях обработки. 1 - спектр без дополнительной обработки, 2 - спектр в том же пике после применения алгоритма CODA, 3 - спектр после применения алгоритма CODA с вычетом фонового спектра, 4 - спектр после применения алгоритма CODA с вычетом фонового спектра после окончательной очистки от фоновых пиков.
спектров №ЗТ. Соединение считали идентифицированным, если помимо внешней схожести масс-спектра с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.